Inleiding

Het Laboratorium voor Moleculaire Celbiologie is leider in het onderzoek naar signaalwegen voor de detectie van nutriënten in gist. Met het Gpr1-Gpa2 systeem hebben ze het eerste nutriënt geactiveerde GPCR systeem ontdekt in eukaryote cellen. Gpr1 is een G-proteïne gekoppelde receptor voor glucose en is aan Gpa2 gekoppeld, een G-proteïne dat bij activatie een cAMP signaal veroorzaakt. Doordat er aanwijzingen zijn dat zoogdieren ook over een GPCR voor glucose beschikken is men recent gestart met het onderzoek naar glucose-sensing mechanismen in zoogdiercellen.

Aan de Universiteit van Liverpool werd aangetoond dat epitheelcellen van de darm van het schaap en de muis de aanwezigheid van glucose detecteren zonder het glucose te transporteren, met een verhoging van het aantal SGLT1 Na+/glucose cotransporters in het borstelzoommembraan tot gevolg. Hetzelfde effect werd waargenomen bij toedienen van de PKA-agonist 8-Br-cAMP. Dit zijn aanwijzingen dat er ook in het darmepitheel van zoogdieren een GPCR is voor glucose die aan een Gα-proteïne gekoppeld is. De laatste jaren zijn dankzij de publicatie van het muisgenoom honderden GPCR’s ontdekt waarvan het ligand niet gekend is, de zogenaamde weesreceptoren of ‘orphan GPCR’s’. De kans is groot dat de receptor voor glucose van de muis één van deze weesreceptoren is.

De eerste stap in het onderzoek naar de glucosereceptor in het epitheel van de dunne darm is de bepaling van welke GPCR’s tot expressie komen in de darmepitheelcellen. In dit onderzoek worden PCR-gebaseerde technieken aangewend om de aanwezigheid van GPCR-mRNA’s aan te tonen in RNA extracten van muizendarmepitheelcellen en van STC-1 cellen, een entero-endocriene cellijn die als modelsysteem geldt voor het darmepitheel. Dit toont enkel aan welke receptorgenen tot transcriptie komen maar zegt niets over de activiteit of de localisatie van het genproduct.

Na dit onderzoek zal functionele screening uitgevoerd worden op de genen waarvan we de expressie in de darmepitheel hebben aangetoond. Enerzijds kan nagegaan worden of overexpressie van het receptorgen het groeidefect kan opheffen in de gpr1D sch9D suiker-sensing deficiënte giststam, Gpa2 zal hiervoor vervangen worden door een chimeer Gα16-Gpa2 proteïne. Anderzijds zal met SiRNA in de STC-1 cellijn de expressie van de aangetoonde receptors uitgeschakeld worden, waarna kan nagegaan worden of dit de stijging van het aantal SGLT1 transporters teniet doet bij toevoegen van glucose.

In dit thesisonderzoek worden de eerste stappen gezet voor een onderzoek naar de glucose-geactiveerde GPCR in de darmwand van zoogdieren. Het aantonen van een GPCR voor glucose in de darm zal niet alleen een nieuw wapenfeit zijn voor een laboratorium met een missie in ‘nutrient-sensing’, het zal ook een belangrijke ontdekking zijn voor de gastro-enterologie en de hele medische wetenschap.

Literatuurstudie

1. Signalering via G-proteïne gekoppelde receptoren

1.1. G-proteïne gekoppelde receptoren.

De evolutie van meercellige organismen is sterk afhankelijk geweest van de capaciteit van hun cellen om signalen van elkaar en de omgeving te ontvangen, door middel van receptoren voor signaalmoleculen. Er zijn slechts vier families van membraangebonden receptoren die intracellulaire boodschappermoleculen en zintuiglijke signalen herkennen. De grootste familie is die van de G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCR’s). GPCR’s behoren tot de oudste systemen voor signaaltransductie en komen voor in planten, gist, slijmzwammen, protozoa en de vroegste diblastische metazoa. (Vernier et al., 1995) GPCR’s komen tussen in de herkenning en transductie van een enorme diversiteit aan signalen: licht, calciumionen, geurstoffen en feromonen, aminozuren, hormonen, chemokines en ook nutriënten. Hun intracellulair domein interageert met heterotrimere guanine nucleotide bindende proteïnen (G-proteïnen). Bij activatie van de receptor komt het G-proteïne vrij en activeert of deactiveert een effector die een intracellulair signaal veroorzaakt.

GPCR’s hebben gemeen dat ze zeven transmembraan-α-helices (TM’s) van 20 tot 25 aminozuren bevatten, verbonden door drie extracellulaire (e1, e2 en e3) en drie intracellulaire lussen (i1, i2 en i3). Aan de N-terminus van alle tot nu toe gekende GPCR’s bevindt zich minstens één consensussequentie voor N-gekoppelde glycosylatie. De hoogste graad van homologie tussen verschillende GPCR’s vindt men terug in de aminozuursequentie van de TM’s. TM’s bestaan voornamelijk uit hydrofobe aminozuren, TM’s 1, 4 en 7 zijn meer hydrofoob dan TM’s 2, 3, 5 en 6. De transmembraanhelices zijn in tegenwijzerzin georiënteerd, gezien vanuit extracellulair standpunt (Unger et al., 1997). De GPCR’s verschillen in de lengte en functie van het N-terminale extracellulaire domein, het C-terminale cytoplasmatische domein, de extracellulaire en de intracellulaire lussen

Op basis van sequentiehomologie kan men de GPCR’s in drie grote families onderbrengen. Familie één is de grootste familie, en bevat receptoren voor retinal (rhodopsine), angiotensine en geurstoffen en adrenerge receptoren, receptoren voor kleine peptiden en receptoren voor glycoproteïnehormonen. Familie één wordt in drie categorieën opgedeeld: 1a, 1b en 1c. Een aantal geconserveerde cysteïneresidu’s spelen een rol in de structuur van de receptoren van familie één. Twee cysteïnes in e1 en e2 vormen een disulfidebrug, die een beperkt aantal conformaties van de 7 TM’s stabiliseert. Een cysteïneresidu is terug te vinden in de C-terminus van veel GPCR’s van familie 1 en is in vele gevallen gepalmytoyleerd. Deze palmitylgroep zou de C-terminus stabiliseren door hem in het plasmamembraan te verankeren. Leden van de 1a-subfamilie zoals rhodopsine en de adrenerge receptoren binden het ligand in een polaire holte tussen de TM’s. De 1b-subfamilie bestaat uit GPCR’s die door kleine peptiden (bijvoorbeeld cytokines, thrombine) worden geactiveerd. Hier bindt het ligand ter hoogte van de N-terminus en de extracellulaire lussen. Subfamilie 1c bestaat uit receptoren voor glycoproteïnehormonen. Een lange N-terminale staart komt samen met e1 en e3 tussen in ligandbinding en receptoractivatie. GPCR’s van familie twee worden geactiveerd door grote peptiden, bijvoorbeeld secretine, glucagon en VIP. Kenmerkend is het grote N-terminale domein. Familie drie bevat de metabotrope glutamaatreceptors en receptors voor feromonen en GABA. Deze receptors bestaan uit een zogenaamde dubbele structuur. Het N-terminale extracellulaire domein vertoont sequentiegelijkenissen met de periplasmatische bindingsproteïnen van bacteriën, die een rol spelen in het transport van aminozuren, ionen of suikers. De ligand-gebonden vorm van het extracellulaire domein activeert dan het 7 TM gebied van de receptor. De feromoonreceptoren in gist zijn GPCR’s die geen gelijkenis vertonen met één van deze drie grote families en worden bijgevolg in een kleine vierde familie geplaatst. (Bockaert en Pin, 1999)

Er bestaat dus een verband tussen de grootte van de liganden die een GPCR kunnen activeren, en de sequentie van de bindende receptoren. Verschillende delen van de receptor kunnen betrokken zijn in de binding van ligand. Bij interacties tussen liganden en receptoren blijken altijd waterstofbindingen, ionenparen en hydrofobe contacten een rol te spelen.

Tussen receptoren van verschillende families is er weinig gelijkenis in aminozuursequentie, men vermoedde dat de GPCR superfamilie door moleculaire convergentie is ontstaan. Door de toename van het aantal gekende GPCR genen in de laatste jaren en de ontwikkeling van sterke informatietechnologie is de hoeveelheid beschikbare informatie sterk toegenomen. Graul en Sadée (2001) combineren verschillende alignerings-strategieën om in een databank van nucleotide- en aminozuur sequenties van GPCR’s naar evolutionaire verwantschappen te zoeken. Zij concluderen dat de GPCR superfamilies wel met elkaar verwant zijn en stellen een cladogram op waarbij de GPCR’s van gist GPR1 en STE2 verre verwanten zijn van familie drie en STE3 een verre verwant van familie één.

Fig.1: Families van GPCR’s (Bockaert en Pin, 1999)

Doordat men van membraanproteïnen zeer moeilijk kristallen kan maken die geschikt zijn voor X-stralen chromatografie, is er over de tertiaire structuur van GPCR’s nog maar weinig informatie beschikbaar. Biochemische, farmacologische en genetische technieken worden gecombineerd met biofysische analyses om belangrijke elementen in het signaleringsmechanisme van GPCR’s te identificeren. Bacteriorhodopsine is geen GPCR, maar eerder een protonpomp. Het is wel structureel verwant met de familie van de GPCR’s. De structuur die door electronendifractie van een tweedimensioneel bacteriorhodopsinechristal gekend is, staat model voor de tertiaire structuur van heel wat GPCR’s. Driedimensionele modellen van GPCR’s kunnen verfijnd worden wanneer meer experimentele gegevens uit bijvoorbeeld mutagenesestudies beschikbaar komen.

Studies op de ‘lichtreceptor’ rhodopsine tonen aan dat de verandering in onderlinge oriëntatie van TM 3, TM 5 en TM 6 essentieel is voor de activatie van het G-proteïne in het ternair complex (Farrens et al., 1996).

Activatie van een GPCR leidt niet enkel tot activering van een signaalweg, maar ook tot desensitisatie van de receptor. Lange termijn desensitisatie wordt gekenmerkt door een afname van receptoren in de uren na activatie. Om het aantal receptoren terug op peil te brengen is de novo proteïnesynthese nodig. Korte-termijn desensitisatie veroorzaakt een snelle stopzetting van de signalering. Resensitisatie kan hier snel optreden zonder de novo proteïnesynthese. Homologe desensitisatie leidt tot een verminderde respons op het specifieke ligand. De GPCR wordt gefosforyleerd door G-proteïne receptor kinasen (GRK), dit is strikt afhankelijk van de activatie van de receptor door hoge concentraties van zijn specifieke ligand. (Walker et al., 2004) Heterologe desensitisatie vermindert de respons op elke stimulus die PKA of PKC activeert. (Tobin, 1997)

1.2. G-proteïnen

Guanine-nucleotide-bindende proteïnen spelen een belangrijke rol in het doorgeven van extracellulaire signalen aan de cel. Ze vormen een soort aan-uit schakelaar voor cellulaire processen, die van buitenaf gereguleerd worden. Ze zijn actief in de GTP-gebonden toestand en inactief wanneer GDP gebonden is. Er zijn twee soorten G-proteïnen die signaaltransductie mediëren: heterotrimere G-proteïnen en kleine GTPasen, waarvan de Ras proteïnen de belangrijkste zijn.

1.2.1. Heterotrimere G-proteïnen

Heterotrimere G-proteïnen bestaan uit een α-, β- en γ-subeenheid. Het ternair-complex-model (ligand, GPCR en G-proteïne in één complex) is het meest aanvaarde model voor GPCR/G-proteïne systemen. Het inactieve G-proteïne is in de heterotrimere vorm gebonden aan de receptor. De Gα-subeenheid heeft GDP gebonden. Bij binding van het ligand aan de GPCR wordt GDP losgelaten en GTP gebonden. De Gα-subeenheid laat los van de Gβ/Gγ-subeenheden en van de receptor. Nu kan zowel GTP-gebonden Gα als het vrije Gβγ-complex het signaal overbrengen naar een effectormolecule. Eén ligand-receptor complex kan meerdere G-proteïnen activeren. Voorbeelden van effectormoleculen zijn adenylaat cyclase, fosfolipasen C en A₂ en transmembraankanalen voor K⁺, Na⁺ en Ca²⁺. Deze effectors amplificeren het signaal nog meer door de vorming van grote hoeveelheden secundaire boodschappers (cAMP, cGMP, IP₃, K⁺, Na⁺ en Ca²). Het Gα-proteïne heeft een intrinsieke GTPase activiteit en veroorzaakt zijn eigen desactivatie door hydrolyse van GTP tot GDP. Het Gα proteïne bindt terug met het Gβγ-complex en het heterotrimere G-proteïne kan terug door een geladen GPCR geactiveerd worden. De Gβ- en Gγ-subeenheden komen in normale omstandigheden niet van elkaar los. Zij vormen samen het Gβγ-complex dat de interactie van de Gα-subeenheid en de receptor stabiliseert, maar ook een effector kan activeren als Gα ervan gedissocieerd is.

Fig 2. De activering van heterotrimere G-proteïnen door GPCR’s

Heterotrimere G-proteïnen worden in klassen verdeeld naargelang het soort Gα-subeenheid. Op basis van sequentiegelijkenissen werden de Gα-proteïnen in vier families onderverdeeld; nl.: G_s, G_i, G_q en G_o. Elk van deze klassen heeft zijn eigen signaalweg, met een specifiek effect op de concentraties van intracellaire boodschappermolecules en de werking van enzymes.

GTP-gebonden Gα_s-subeenheden activeren adenylaat cyclase, dat ATP omzet in 3’5’ cyclisch AMP (cAMP). cAMP activeert het cAMP-afhankelijke proteïne kinase (PKA) door binding aan de regulatorische subeenheden. PKA verbindt het cAMP signaal met verschillende systemen, zoals ion kanalen, transcriptiefactoren en metabolische enzymen. Cholera toxine zorgt door ADP-ribosylatie van G-proteïnen dat ze in de geactiveerde GTP-gebonden toestand blijven.

Gα_i- en Gα_o-proteïnen inhiberen adenylaat cyclase door eraan te binden maar het niet te activeren. Zij werken dus antagonistisch aan G_s-proteïnen. Ook het Gβγ-complex van deze G-proteïnen kan interageren met effectormoleculen zoals K⁺-kanalen, fosfolipase C (PLC) en inositol-3-fosfaat kinase (IP3K). Pertussis toxine hecht een ADP-ribosyl-groep aan het COOH uiteinde van deze G-proteïnen waardoor deze niet meer door een receptor kunnen geactiveerd worden.

De G_q-signaalweg stimuleert PLC om de secundaire boodschappers inositol-trisfosfaat (IP3) en diacylglycerol (DAG) te vormen door fosforolyse van een fosfodiëster. IP3 stimuleert de vrijzetting van Ca²⁺ uit intracellulaire opslagplaatsen en DAG recruteert het Ca²⁺-afhankelijke proteïne kinase (PKC) naar het membraan en activeert het. Het vrijgestelde Ca²⁺ induceert een verdere stijging door activatie van Ca²⁺-kanalen in het plasmamembraan, tot een bepaald niveau, waarbij het Ca²⁺ snel terug weggepompt wordt. De activatie van de G_q-signaalweg resulteert dus in een verhoogde frequentie in de oscillaties van de Ca²⁺-concentratie, eerder dan in permanente accumulatie van Ca²⁺ (Berridge, 1991)

1.2.2. Kleine GTPasen: Ras proteïnen

Ras proteïnen zijn GTPasen met een lage molecuulmassa, die sterk geconserveerd zijn in eukaryote organismen. Ze maken deel uit van de Ras superfamilie van GTPasen, die nog twee andere grote families bevat: Rho/Rac proteïnen die betrokken zijn in de organisatie van het cytoskelet, en Rab proteïnen die het transport van vesikels tussen verschillende intracellulaire compartimenten reguleren.

De Guanine nucleotide uitwisselingsfactor (GEF) speelt hier de rol van geactiveerde GPCR, GEF bindt aan het Ras proteïne waardoor GDP dissocieert. Hierna bindt GTP spontaan aan het Ras proteïne waardoor GEF dissocieert. In tegenstelling tot de Gα-subeenheid van heterotrimere G-proteïnen kunnen Ras proteïnen zelf maar zwak GTP hydrolyseren. De deactivatie van Ras gebeurt door de binding van een GTPase activerend proteïne (GAP) en hydrolyse van het GTP, waarbij fosfaat en GAP dissociëren van het het Ras proteïne. GEF’s en GAP’s zijn dus respectievelijk activator en inhibitor van Ras signalering, die ook in andere families van de Ras superfamilie voorkomen. (Bugoski en McCormick, 1993)

2. Glucose-sensing

Glucose is de primaire brandstof voor de meeste cellen. Het is de koolstofbron voor de glycolyse, de glycogeensynthese en de pentosefosfaatweg. Omdat de hoeveelheid beschikbare glucose sterk kan veranderen moet de cel over een sensorsysteem en signaalwegen beschikken die het metabolisme eraan aanpassen. De respons is afhankelijk van het soort cel. Glucose-sensing omvat de mechanismen waarop een cel de beschikbaarheid van glucose in zijn omgeving detecteert, en deze informatie doorgeeft aan cellulaire regulatieproteïnen.

Glucose is dus naast nutriënt ook boodschappermolecule voor cellen. De laatste jaren is de interesse voor glucose-sensing mechanismen sterk toegenomen, waardoor belangrijke kennis over de meest uiteenlopende organismen is verworven. Bij gist werden proteïnen met een directe rol in glucose-signalering ontdekt. In planten vindt men ook een diversiteit aan glucose-geïnduceerde signalen en in zoogdieren constateert men dat glucose-sensing een onmisbaar instrument is, dat door een grote verscheidenheid aan signaaltransductiewegen wordt gemedieerd in een groot aantal uiteenlopende cellen, weefsels en organen.

2.1. Mogelijke glucose-sensing mechanismen in eukaryote cellen.

Omdat glucose naast boodschappermolecule in de eerste plaats een nutriënt is voor de cel, zijn er veel meer mogelijke manieren waarop de aanwezigheid ervan kan gedecteerd worden dan het geval is voor klassieke boodschappers, zoals hormonen.

Glucose kan gedetecteerd worden door specifieke glucose-receptoren in het plasmamembraan ofwel op basis van zijn transport en metabolisme. In het eerste geval kan de receptor een niet-transporterende glucosecarrier-homoloog (Fig.3 c) zijn, die tot een glucosesensor is geëvolueerd. Anderzijds kan de receptor ook behoren tot een gekende familie van ligand-bindende receptoren die structureel niet verwant is met een glucosecarrier. Bijvoorbeeld een GPCR met een specifieke bindingsplaats voor glucose (Fig.3 a).

Als het glucose-sensing mechanisme gekoppeld is aan het metabolisme, kan het uitgevoerd worden door een actieve glucosecarrier (Fig.3 b) of door een metabolisme-afgeleid signaal. In het eerste geval activeert de transporterende carrier het volgende proteïne in de signaalweg. In het tweede geval kunnen glucose-6-fosfaat, en andere metabolieten van glucose, dienen als ‘metabolische boodschapper’. Dit soort indirecte signalering veroorzaakt een eerder onspecifiek signaal: het beïnvloedt verschillende signaalwegen en doelwitten.

Een actief glucose fosforylerend enzym (Fig.3 e) kan dan de signalerende component zijn doordat het in de katalytisch actieve conformatie interageert met stroomafwaartse componenten in de signaalweg. Homologen van glucose fosforylerende enzymen met een zwakke of geen katalytische functie (Fig.3 d) kunnen ook een signaal genereren, zoals bij niet-transporterende glucosecarrier-homologen. Eindproducten van het glucose-metabolisme, zoals ATP en reducerend vermogen, kunnen ook dienen als signaal. (Fig.3 f) Bovendien kunnen twee of meer mechanismen samen een effect veroorzaken. (Rolland et al., 2002)

Dat pas recent het eerste nutriënt-geactiveerde GPCR-systeem werd ontdekt (Kraakman et al., 1999) is te wijten aan de uitgebreide alternatieve mogelijkheden voor detectie van nutriënten, zowel binnenin de cel als ter hoogte van het membraan, uitgaande van de gekende enzymen die met het nutriënt of zijn producten in contact komen.

Fig.3 Mogelijke mechanismen voor detectie van glucose in eukaryote cellen (Rolland et al., 2002)

2.2. Experimentele benaderingen

Een belangrijke vraag bij het onderzoeken van de signaalwegen is of de regulerende functie kan losgekoppeld worden van de nutriënt-functie. Daarom wordt in de eerste plaats nagegaan of het regulerende effect ook kan worden teweeggebracht door niet of slechts gedeeltelijk metaboliseerbare analoge substraten. Als 6-deoxyglucose en 3-O-methylglucose (glucose-analoge substraten die worden getransporteerd maar niet verder gemetaboliseerd) het regulerende effect van glucose induceren, kan men besluiten dat signalering gebeurt ter hoogte van het glucosetransport. Als 2-deoxyglucose (een analoog dat getransporteerd en gefosforyleerd wordt, maar niet verder gemetaboliseerd) het effect induceert, gebeurt signalering waarschijnlijk door het enzyme dat glucose fosforyleert. Als L-glucose (het niet transporteerbare enantiomeer van het veel meer voorkomende D-glucose) de signaalweg activeert, kan men aannemen dat signalering gebeurt door een receptor op het celoppervlak. Ook studies met mutante cellijnen, die beschikken over een deficiënt glucosemetabolisme en studies met specifieke inhibitoren (bijvoorbeeld: de hexokinase inhibitor manoheptulose) zijn nuttig geweest. Een probleem met deze methoden is echter dat ze een snelle uitputting van het ATP veroorzaken, in tegenstelling tot het normale effect van glucose.

Door electroporatie van plantenprotoplasten en de introductie van hexosefosfaten (waarvoor het celmembraan normaal impermeabel is) kan men de signaleringsrol van een actief hexokinase omzeilen (Jang en Sheen, 1994). Regulerende domeinen van proteïnen die zowel voor glucosemetabolisme als voor glucosesensing nodig zijn, kunnen geïdentificeerd worden door screening van mutanten of door expressie van homologe proteïnen uit andere organismen. Hoe meer metabolisatie (voorbij transport en fosforylatie) vereist is voor de regulerende effecten van glucose, hoe moeilijker het is om de signaalweg bloot te leggen. Een mogelijke benadering is het gebruik van alternatieve substraten die hetzelfde product genereren. Zo kon men aantonen dat stoffen die het ATP niveau doen stijgen, insulinesecretie stimuleren in β-cellen van de pancreas, wat aangeeft dat ATP hier een ‘metabolische boodschapper’ is. (Schuit et al., 2001)

3. Glucose-sensing in Saccharomyces cerevisiae.

3.1. Gist en glucose: stationaire fase, respiratie en fermentatie.

Eencellige, vrijlevende organismen, zoals gist, zijn over het algemeen zeer goed aangepast aan constant veranderende omgevingen. Ze hebben mechanismen ontwikkeld om op extreme variaties in de nutriëntbeschikbaarheid te reageren, meer bepaald door hun groei en metabolisme eraan aan te passen. De beslissing om te proberen groeien bij nutriëntlimitatie zou nefast zijn voor de overleving van micro-organismen.

Het meest dramatische effect is waarneembaar bij uithongering of ‘nutrient starvation’. Micro-organismen kunnen lange perioden overleven in afwezigheid van één of meer nutriënten door het stilleggen van de celcyclus in combinatie met een aantal fysiologische veranderingen; de cel gaat in ‘stationaire fase’. Gistcellen in stationaire fase worden gekenmerkt door hun hittebestendigheid en hun weerstandigheid aan andere stressfactoren. Ze accumuleren hoge concentraties aan de reservestoffen glycogeen en trehalose. Hoewel gist normaal een eencellige schimmel is kan nutriëntlimitatie, bijvoorbeeld stikstof-deprivatie, een drastische morfogenetische switch veroorzaken, die resulteert in de vorming van pseudohyfen. Deze filamenteuze draden stellen het organisme in staat actief op zoek te gaan naar stikstofbronnen. (Gagiano et al., 2002)

In aanwezigheid van zuurstof zijn gistcellen in staat ATP te genereren uit niet-fermenteerbare koolstofbronnen (bijvoorbeeld glycerol, lactaat, ethanol) door oxidatieve fosforylatie in de mitochondriën. Respirerende cellen groeien veel trager dan fermenterende cellen en vertonen nog andere kenmerken van de stationaire-fase-cellen zoals hoge expressie van genen betrokken bij stressresistentie en accumulatie van reservekoolhydraten.

Glucose-gevoelige gistspecies zoals Saccharomyces cerevisiae en in mindere mate Schizosaccharomyces pombe verkiezen fermentatie boven respiratie, ook in aanwezigheid van zuurstof. De enzymen die noodzakelijk zijn voor respiratie, gluconeogenese en metabolisatie van alternatieve suikers worden niet gesynthetiseerd in aanwezigheid van glucose. Respiratie levert meer ATP op per mol suiker dan alcoholische fermentatie. Alcoholische fermentatie verloopt echter sneller dan respiratie en het gevormde ethanol kan nog worden gerespireerd als het glucose is opgebruikt. Het belangrijkste voordeel evenwil is dat ethanol de groei van concurrerende micro-organismen inhibeert, vermits gistcellen zeer ethanol-resistent zijn. (Pronk, 2000) Additie van snel fermenteerbare suikers aan respirerende gistcellen of gistcellen in stationaire fase veroorzaakt een aantal regulerende effecten. Deze dienen om het exclusieve en optimale gebruik van de fermenteerbare bron te verzekeren. Het glucosetransport en de glycolyse worden geactiveerd, terwijl gluconeogenese en de genen voor respiratie en metabolisme van alternatieve koolstofbronnen worden geïnhibeerd. Er is een sterke stijging van de groeisnelheid, voorafgegaan door een verhoogde transcriptie en translatie. De gistcellen worden gevoeliger aan stress (hitte, bevriezing, hoge osmolariteit,…) en trehalose wordt afgebroken. (Rolland et al., 2002)

3.2. Glucose-sensing mechanismen in S. cerevisiae

Gistcellen gebruiken zowel positieve als negatieve controlemechanismen om te reageren op de beschikbaarheid van glucose in het medium. Enzymconcentraties worden gereguleerd door repressie en inductie van de transcriptie van genen, stabiliteit van het mRNA en stabiliteit van het eiwit. De activiteit van enzymen wordt post-transcriptioneel gereguleerd door allosterische en covalente activatie en inhibitie. De signaalwegen die verantwoordelijk zijn voor de fenotypische effecten van glucosesignalering zijn glucose-repressie, glucose-inductie en de Ras-cAMP signaalweg

De dramatische effecten van glucose op gistcellen zijn een aanwijzing dat glucose-sensing via een directe signalering verloopt, met een receptor in het plasmamembraan. Omdat glucose echter ook opgenomen en afgebroken wordt in S. cerevisae, zijn er ook aanknopingspunten voor indirecte signalering. Hoewel de cel dus ook de activiteit van een bestaande metabolische component of de aanwezigheid van een of meer catabolieten kan gebruiken voor de detectie van glucose (en van de afbraak ervan), heeft het gebrek aan specificiteit van dergelijk systeem de ontwikkeling van specifieke sensoren gestimuleerd.

Het is bewezen dat gist verschillende sensing-mechanismen combineert om de groei en metabolische activiteit precies aan te passen aan de hoeveelheid en kwaliteit van de beschikbare suikers. De inductie van glycolytische enzymen door glucose is afhankelijk van de accumulatie van intermediaire metabolieten, hexose-6-fosfaten of glycolytische metabolieten met drie koolstofatomen. De meeste glucose-geïnduceerde effecten in gist vereisen meestal slechts gedeeltelijke metabolisatie. De meeste signaalwegen zijn onafhankelijk van de stappen in de glycolyse die na de suiker-kinase stap komen. Dit wijst op een centrale rol voor transport en fosforylering in het waarnemen van extracellulaire glucose. Bovendien zijn suikertransport en fosforylering zelf gereguleerd door verschillende signaaltransductiesystemen.

3.2.1. Glucose-repressie of ‘catabolite repression’: sensing door hexokinase

Repressie-effecten van glucose spelen zich hoofdzakelijk af op het transcriptionele niveau. Glucose represseert de transcriptie van de genen voor respiratie (enzymen van de Krebs-cylcus en de elektronentransportketen), gluconeogenese, de glyoxylaatcyclus, GAL, SUC en MAL genen voor het gebruik van alternatieve suikers en de genen betrokken bij het gebruik van ethanol, lactaat en glycerol. Hoge beschikbaarheid van glucose inhibeert ook genen voor hoge-affiniteits glucosetransporters. Ook de inducers van genen voor het gebruik van alternatieve koolstofbronnen worden vaak door glucose gerepresseerd. Tenslotte wordt ook een grote groep STRE-genen (stress response element) gerepresseerd, die de respons op verschillende stressfactoren mediëert.

Het sensing mechanisme dat de glucose-repressie signaalweg activeert, vereist transport, fosforylatie en geen verdere metabolisatie van glucose. Dit werd aangetoond met 2-deoxyglucose en fosfoglucoisomerase-mutanten (Pego et al., 1999). Glucosetransport lijkt enkel nodig te zijn om de aanvoer van glucose voor fosforylering te verzorgen (Reifenberger et al., 1997). Dit maakt aannemelijk dat er geen rol is voor glucosetransporters in dit proces. Drie suiker-kinasen, hexokinase (Hxk) 1 en 2 en glucokinase (Glk1), katalyseren de fosforylering van glucose, maar de glucoserepressie vereist specifiek Hxk2. Dit is het meest actieve suikerkinase van de drie, vooral in fermenterende gistcellen. Het blijft echter onduidelijk hoe Hxk2 precies betrokken is bij glucose-repressie.

Er zijn studies uitgevoerd die een correlatie aantoonden tussen de activering van de glucose-repressie en de kinase-activiteit van mutante allelen van Hxk2, wat suggereert dat hexosefosfaten als signaalmolecule zouden dienen (Rose et al., 1991). Later zijn echter ook mutante allelen geïdentificeerd waarin deze fenomenen van elkaar ontkoppeld zijn, wat eerder wijst op een signaleringsrol voor het actieve Hxk2 . De transitietoestand van het enzym-substraat-complex zou dan specifiek interageren met de volgende component van de signaaltransductieweg. (Hohman et al.,1999)

Door vergelijking van giststammen die verschillende combinaties van deze enzymen tot expressie brengen, is het belang van de verschillende hexose kinasen voor de glucoserepressie opgehelderd. Een initiële respons wordt gemedieerd door alle enzymen die glucose fosforyleren, wat doet vermoeden dat glucose-6-fosfaat het signaal doorgeeft. Langetermijnrepressie door glucose daarentegen, vereist specifiek Hxk 2. Hxk1 en Glk1 worden gerepresseerd na toevoegen van glucose en hun activiteit wordt bovendien door het cAMP-afhankelijk proteïne kinase, PKA, gereguleerd. (De Winde et al., 1996)

Recente gegevens tonen aan dat Hxk2 een directe rol heeft in het signaleren van glucose aan het repressie-apparaat. Hxk2 bevindt zich zowel in de nucleus als in het cytoplasma. De aanwezigheid in de nucleus is noodzakelijk voor glucose-repressie; bovendien is aangetoond dat Hxk2 deel uitmaakt van DNA-proteïne complexen met regulatorische elementen van de SUC2 promoter. (Herrero et al., 1998) Dus Hxk2 zou het glucose-signaal kunnen doorgeven door directe interactie met transcriptiefactoren, die de expressie van glucose-gerepresseerde genen controleren.

3.2.2. Glucose-inductie: glucose-sensing door ‘metabolische boodschappers’ en glucosetransporter-homologen.

Omdat fermentatie een relatief inefficiënte manier is om energie te winnen, in vergelijking met respiratie, is een hoge glucoseflux noodzakelijk. In aanwezigheid van glucose vergroten gistcellen de glycolytische capaciteit door inductie van een groot aantal glycolytische genen. Bovendien verhoogt de opname van glucose door de inductie van verschillende glucosetransporter genen (HXT genen). Hier zijn aparte signaaltransductiewegen bij betrokken. Mutantenstudies hebben aangetoond dat de verhoogde concentraties van verschillende metabolieten de inductie van de glycolytische genen initieert. (Boles et al., 1993) Verschillende glycolytische intermediairen blijken als signaalmolecule (metabolic messenger) te werken in de adaptatie van de cel aan wijzigende concentraties van fermenteerbare suikers. Dit gebeurt op een complexe, maar sterk gecontroleerde en efficiënte manier.

Twee leden van de glucosetransporterfamilie, Snf3 en Rgt2, vertonen geen actief transport maar hebben een regulatorische functie. Snf3 is noodzakelijk voor de inductie van transcriptie van HXT2, HXT3 en HXT4, hoge-affiniteits transporters, door lage concentraties aan glucose, terwijl Rgt2 vereist is voor de maximale inductie van het HXT1 gen, dat codeert voor de lage-affiniteits transporter Hxt1, door hoge concentraties aan glucose (Özcan et al., 1995; Özcan et al., 1996). Dit is o.a. aangetoond door analyse van een dominante puntmutatie in Rgt2 die constitutieve glucose-onafhankelijke expressie van HXT1 veroorzaakt. Als men dezelfde puntmutatie in Snf3 introduceert, komt HXT2 constitutief tot expressie. Rgt2 is de sensor voor hoge extracellulaire glucoseconcentraties, Snf3 is de sensor voor lage glucoseconcentraties. Snf3 wordt door glucose gerepresseerd, terwijl Rgt2 constitutief aanwezig is. (Rolland et al., 2002) De structuur van Rgt2 en Snf3 is vooral verschillend ten opzichte van andere glucosetransporters omwille van het lange C-terminale uiteinde dat zich in het cytoplasma bevindt en essentieel is voor de werking als glucosereceptor. Van twee proteïnen, Mth 1 en Std1, is aangetoond dat ze binden aan de C-terminale uiteinden van de receptoren. Deze hebben een repressief effect op de expressie van de hexosetransporters en het invertase, wat suggereert dat ze betrokken zijn in de transductie van het glucose-signaal voor regulatie van de expressie van SUC2 en de HXT genen. (Lafuente et al., 2000; Schmidt et al., 1999)

3.2.3. Geactiveerd PKA fenotype: de Ras-cAMP signaalweg en de FGM signaalweg

Heel veel eigenschappen van gistcellen worden gereguleerd door PKA. Alleen als alle voorwaarden voor fermentatieve groei vervuld zijn (aanwezigheid van een fermenteerbare koolstofbron en van een bron van elk van de elementen stikstof, zwavel en fosfaat) is PKA blijvend geactiveerd. Actief PKA zorgt voor een versnelde celcyclus en een verhoogde expressie van ribosomale genen. De sporulatiecapaciteit is verlaagd, maar de mogelijkheid om pseudohyfen te vormen verhoogd. De celwand is zwakker bij het geactiveerd PKA fenotype, de concentratie aan reservestoffen is lager, en de stress-resistentie is verminderd.

Glucose en andere snel fermenteerbare suikers zijn gekende activators van de cAMP signaalweg in gist. Naast glucose kan ook intracellulaire verzuring de cAMP signaalweg activeren. Tot voor kort dacht men dat zowel glucose als intracellulaire verzuring de signaalweg activeerde via Cdc 25 en de Ras proteïnen. In 1998 werd echter door Colombo et al. aangetoond dat de hoevelheid GTP gebonden op de Ras-proteïnen niet gewijzigd werd door toediening van glucose aan gederepresseerde cellen, maar enkel na verzuring van de cellen. Zij toonden aan dat een ander Gα-proteïne, Gpa2, betrokken was in de glucose-geïnduceerde activatie van de cAMP-signaalweg. Gpa2 is een heterotrimeer G-proteïne waarvan deletie de activatie van de signaalweg verhindert, wat erop wijst dat het vereist is voor activatie van de cAMP-signaalweg door glucose.

Via gist ‘two hybrid’ screening werd Gpr1 geïsoleerd als interagerend proteïne met Gpa2 (Xue et al., 1998; Kraakman et al., 1999). Tegelijkertijd werd Gpr1 ook ontdekt via mutant-analyse, door screening voor mutanten met deficiëntie van fermentatie-geïnduceerd verlies van hitteschok resistentie. De fil2 mutant bevat een ‘ochre non-sense’ mutatie in een intracellulaire lus van Gpr1, met verlies van de Gpr1-functie tot gevolg. In een gelijkaardige mutant-analyse werd ook RGS2 geïsoleerd, een gen dat codeert voor een proteïne met een typisch RGS-domein (Regulator of heterotrimeric G-protein Signaling), Rgs2, dat de GTPase activiteit van Gpa2 stimuleert en het cAMP-signaal dus doet afnemen.

Gpr1 is noodzakelijk voor de glucose-geïnduceerde activatie van de cAMP synthese en heeft alle specifieke kenmerken van een GPCR. Samen met het gegeven dat Gpa2 vereist is voor activatie van de cAMP-signaalweg, duidt dit aan dat glucose-sensing voor activatie van adenylaat cyclase gebeurt via het GPCR systeem dat bestaat uit de glucose-receptor Gpr1 en zijn geassocieerd Gα-proteïne Gpa2. Dit komt overeen met het activatiemechanisme dat gekend is in hogere organismen. Het is bovendien het eerst ontdekte voorbeeld van een nutriënt-geactiveerd GPCR-systeem in eukaryote cellen. In Schizosaccharomyces pombe en in Candida albicans werden homologen gevonden van Gpr1, wat het bestaan van een GPCR-familie betrokken in glucose-sensing doet vermoeden (Versele et al., 2001)

Controle over de cAMP-signaalweg gebeurt op meer dan één niveau. Naast het Gpr1-Gpa2 GPCR systeem is de activatie van de Ras-cAMP signaalweg ook afhankelijk van opname en fosforylatie van glucose (Buellens et al., 1988). Het lijkt erop dat fosforylatie noodzakelijk is om het adenylaat cyclase gevoelig te maken aan stimulatie door Gpa2. Onlangs is aangetoond dat extracellulaire glucose aanleiding geeft tot het cAMP signaal in giststammen die geen glucose opnemen (hxt1-7 hexosetransporter deletie stammen) op voorwaarde dat er een inwendige bron van het suiker aanwezig is om een laag niveau van glucose fosforylering te onderhouden (Rolland et al., 2000). Dit werd bereikt door pre-additie van een kleine hoeveelheid maltose, dat door een specifieke maltosetransporter wordt opgenomen en het cAMP signaal niet induceert. Dit cAMP signaal dat door extracellulaire glucose geïnduceerd wordt is strikt afhankelijk van de aanwezigheid van Gpr1. Met gebruik van gelijkaardige experimenten werd ook aangetoond dat het Gpr1-afhankelijke cAMP-signaal specifiek is voor glucose en sucrose, geen van de andere suikers of suiker-analogen die werden getest konden de activatie initiëren.

Deletie van Gpr1 resulteert enkel in een vertraging van de veranderingen van de PKA-doelwitten om zich aan te passen aan groei op glucose, maar de typische PKA-gecontroleerde fenotypes tijdens de fermentatieve groei worden niet beïnvloed. Activatie van de Ras-cAMP signaalweg na glucose-inductie veroorzaakt een tijdelijke stijging van het cAMP gehalte in de cel en heeft slechts een tijdelijk effect op PKA en haar doelwitmoleculen. Nochtans blijft PKA tijdens de groei op glucose en andere fermenteerbare koolstofbronnen actief. Bovendien wordt de PKA-activiteit onderdrukt in een voedingsmedium waarin een fermenteerbare koolstofbron aanwezig is, maar een ander essentieel nutriënt, zoals stikstof, ontbreekt. Deze eigenschappen veronderstellen een signaalweg die informatie betreffende de aanwezigheid van alle essentiële voedingsstoffen in het milieu integreert en een fysiologische respons medieert via PKA. Omwille van de behoefte aan zowel glucose en aan een compleet groeimedium werd deze signaalweg de FGM-signaalweg (Fermentable Growth Medium) genoemd (Thevelein, 1994). Het vermoeden dat er een signaalweg bestaat die PKA activeert, onafhankelijk van cAMP, wordt op twee manieren bevestigd. Enerzijds doordat cAMP synthese niet wordt geactiveerd tijdens de groei op glucose. Anderzijds wordt PKA op een cAMP-onafhankelijke manier geactiveerd als men stikstof toevoegt aan een stikstof-gedepriveerde gistcultuur, die over een fermenteerbare koolstofbron beschikt.

De schijnbare affiniteit van Gpr1 voor zijn vermeende ligand, glucose, is zeer laag: er is 20 à 30 mM glucose nodig om de helft van de maximale activatie van het cAMP signaal te bekomen in vivo. Dit is in overeenstemming met de fysiologische context waarin Gpr1 functioneert: de transitie van een respiratief naar een fermentatief metabolisme gebeurt pas volledig bij glucose-concentraties van minstens 20mM (Thevelein, 1991). Andere systemen nemen glucose al waar in het micromolair gebied. Gpr1 speelt dus een rol in het detecteren van hoge beschikbaarheid van glucose in het medium. Na de snelle activatie van PKA door de Ras-cAMP weg, neemt de FGM-signaalweg deze functie over tijdens de groei op glucose. De Ras-cAMP weg fungeert als boodschapper die tijdens de overgang van niet-fermenteerbaar naar een fermenteerbaar medium de cel in staat stelt zich snel aan te passen.

Het proteïne kinase Sch9 is betrokken bij de FGM signaalweg. Deletie van SCH9 veroorzaakt een partieel groeiprobleem en verhindert trehalase-activatie door een stikstofbron in cellen die opgegroeid zijn in een stikstof-vrij glucose-bevattend medium, terwijl deletie van GPR1 of GPA2 hier geen invloed op heeft. Bijkomende deletie echter van GPR1 of GPA2 in een sch9Δ mutant schakelt de groei omzeggens geheel uit. Dit suggereert dat Gpr1 en Gpa2 niet betrokken zijn in de activatie van de FGM signaalweg. In een stam waar glucose fosforylatie onmogelijk is (hxk1Δ hxk2Δ glk1 Δ), of in gpr1Δ is er nog steeds een stikstof-geïnduceerde trehalase-activatie aanwezig (Pernambuco et al., 1996). Dit toont aan dat het Gpr1-Gpa2 systeem vereist is voor activatie van de FGM pathway wanneer fosforylering van de suiker afwezig is. Dit staat in tegenstelling met de glucose-activatie van de cAMP signaalweg, waar zowel extracellulaire suikerdetectie als intracellulaire fosforylering noodzakelijk zijn (Lemaire, 2000). Ook voor de activatie van de FGM signaalweg is nog niet duidelijk hoe suikerfosforylering en suikerdetectie met elkaar verbonden zijn.

Heel recent werd door ‘SCAM analyse’ (Substituted Cysteïne Accessibility Method) en door gedetailleerde analyse van puntmutaties aangetoond dat glucose en sucrose direct aan Gpr1 binden, meer bepaald aan transmembraandomein 6 (TM6). (Lemaire et al., 2003 submitted)

4. Glucose-sensing in zoogdieren

4.1 Glucosehomeostase: glucose-sensing in de β-cellen van de pancreas

In zoogdieren doet glucose dienst als de voornaamste suiker in het bloed en de concentratie ervan wordt nauwkeurig gecontroleerd, zodat deze binnen een specifiek interval blijft. Het onderhouden van een constant glucosegehalte in het bloed vereist een glucose-sensing mechanisme dat in staat is de hoeveelheid glucose in het bloed waar te nemen. Deze functie wordt uitgeoefend door de β-cellen van de pancreas, die bij het waarnemen van een stijging van het glucosegehalte in het bloed insuline zullen secreteren. Insuline stimuleert de opname van glucose bij vele celtypes en vooral bij levercellen, waar de suiker wordt opgeslagen als glycogeen. Hierdoor daalt de hoeveelheid glucose in het bloed. De homeostatische functie van de ß-cellen is afhankelijk van de opname van glucose door deze cellen en van de daaropvolgende transductiewegen die de exocytosesnelheid beïnvloeden.

De opname van glucose door de β-cellen wordt verzorgd door GLUT2 glucose transportmoleculen, die door de β-cellen tot expressie worden gebracht in de plasmamembraan. Deze moleculen laten een snel transport toe van glucose, onafhankelijk van de extracellulaire glucoseconcentratie. Na opname door de β-cellen worden de glucosemoleculen gefosforyleerd, en vervolgens opgenomen in de glycolyse. Indien lage gehaltes van glucose aanwezig zijn, wordt er slechts weinig glucose gefosforyleerd, hoogstwaarschijnlijk ten gevolge van een lage expressie van hexokinase isovormen met hoge affiniteit (hexokinase I, hexokinase II of hexokinase III). Bijgevolg is er slechts een lage glycolytische flux waardoor de ATP/ADP verhouding aan de lage kant blijft (Schuit et al., 2001). Bij hogere glucosegehaltes gebeurt de fosforylatie van glucose door hoog-affiniteits glucokinase (hexokinase IV), een enzyme dat in β-cellen gereguleerd wordt door subcellulaire lokalisatie (Rolland et al., 2001). Hierdoor verhoogt de glycolytische flux en bijgevolg stijgt de ATP/ADP verhouding. Deze verschuiving bij de adenine nucleotiden zorgt ervoor dat ATP-gevoelige kaliumkanalen zullen sluiten. De daling van de hoeveelheid ADP draagt ook bij tot dit effect. In aanwezigheid van Mg²⁺ werkt ADP de inhiberende werking van ATP tegen via de sulfonylurea receptor 1 (SUR1), de geassocieerde regulatorische subeenheden van de ATP-gevoelige K⁺ kanalen (Shyng et al., 1998). Door sluiting van deze kanalen treedt membraandepolarisatie op. Als gevolg van deze depolarisatie openen de voltage-afhankelijke calciumkanalen, waardoor de intracellulaire calcium concentratie stijgt. Deze stijging induceert de exocytose van insuline door get versmelten van secretorische vesikels met de plasmamembraan.

De glucose signalen voor secretie van insuline werken synergistisch met de door glucagon geïnduceerde stijging van de hoeveelheid intracellulair cAMP. Het exacte mechanisme van dit synergisme is nog niet gekend maar waarschijnlijk vindt deze plaats ter hoogte van de doelwitproteïnen die tussenkomen in de exocytose. De normale snelheid van door glucose geïnduceerde vrijzetting van insuline wordt dus door minstens twee mechanismen onderhouden. Het eerste mechanisme is een versnelling van de metabolische flux, die gecontroleerd wordt ter hoogte van de fosforylatie van glucose door glucokinase. Het tweede mechanisme is de produktie van cAMP, die gestimuleerd wordt door glucagon en de incretine hormonen GLP-1 en GIP (Schuit et al., 2001).

Het gen van glucokinase wordt in β-cellen gereguleerd door een zwakke promotor. Dit zorgt ervoor dat de expressie van dit enzyme in β-cellen aan de lage kant blijft in vergelijking met parenchymcellen van de lever. Hierdoor is de glucokinase activiteit in ß-cellen de snelheidsbepalende stap in het glucosemetabolisme. Er werd reeds aangetoond dat kleine veranderingen in de hoeveelheid glucokinase de gevoeligheid van de cellen voor glucose beïnvloeden, terwijl een grote toename van de expressie van glucokinase de glucose-sensing eigenschappen sterk verstoort (Schuit et al., 2001).

In een poging nieuwe componenten te isoleren die tussenkomen in glucose-sensing in ß-cellen werd gezocht naar genen uit deze beta-cellen die in staat waren het lethaal effect te suppresseren van de dubbele deletie van Sch9 en Gpr1 in gistcellen. Verschillende cDNA's die op deze manier geïsoleerd werden, coderen voor proteïnen met gekende functies, en hun effect in deze screening kan begrepen worden aan de hand van deze functies. Bijkomend werden drie nieuwe genen met ongekende functie geïsoleerd. Hoewel de groei van de getransformeerde cellen heel wat trager was dan de groei van wild type cellen, werd de levensvatbaarheid van de dubbele mutanten hersteld. Het cDNA met het sterkste effect werd geselecteerd voor verdere studie. Analyse van de DNA sequentie doet vermoeden dat het om een transcriptiefactor gaat. De 'Mammalian Transcription factor Activating the cAMP pathway in yeast' of MTAC, een proteïne met 574 aminozuren, is in gistcellen gelokaliseerd in de kern en is in staat op zichzelf de expressie van een reportergen te stimuleren in een two-hybrid experiment. Micro-array analyse heeft aangetoond dat de expressie van verschillende genen gestimuleerd of geïnhibeerd wordt door MTAC, en analyse van de promotors van deze genen resulteerde in een aantal mogelijke herkenningssequenties. Het is nog niet duidelijk of MTAC zelf rechtstreeks op het DNA bindt.

4.2. Regulatie van glucosetransport in de zoogdierdarm.

Naast de mechanismen die instaan voor het waarnemen en reguleren van de glucoseconcentratie binnen het lichaam, moeten zoogdieren ook de aanwezigheid van glucose aan de buitengrenzen van hun lichaam kunnen detecteren. Ter hoogte van de smaakpappilen en het darmepitheel wordt de aanwezigheid van glucose rechtstreeks gedetecteerd, onafhankelijk van de glucoseconcentratie in het bloed.

4.2.1. Anatomie en fysiologie van de dunne darm.

Actieve en passieve absorptie van nutriënten uit het voedsel gebeurt volledig ter hoogte van de dunne darm en zijn structuur en activiteit zijn daaraan aangepast. De dunne darm van zoogdieren wordt begrensd door het darmepitheel, dat dankzij de vele plooien en vingervormige uitstulpingen (villi) een groot oppervlak beslaat. De enterocyten vormen een gepolariseerd epitheel, de ene kant van het membraan van de cellen verschilt in structuur en functie van de andere kant. ‘Dichte juncties’ vormen de grens tussen het apicale en het basolaterale oppervlak van de cellen. Naargelang de fysiologische rol van het epitheel waar dichte juncties deel van uitmaken zijn ze al dan niet permeabel. De dichtheid van het dichte junctie netwerk wordt in de darm gereguleerd vanuit de cel.

Het apicale oppervlak is nog vergroot door talloze membraanuitstulpingen met actinefilamenten als skelet (microvilli) en is gespecialiseerd in absorptie van nutriënten. De toppen van de microvilli worden bedekt door de glycocalyx, die bestaat uit een los netwerk van oligosaccharidezijketens van membraanproteïnen, glycolipiden en verteringsenzymen. De borstelzoom of ‘brush border’ is de aflijning tussen het darmlumen en het cytosol van de enterocyten en bestaat uit de glycocalyx en de microvilli, het apicale gedeelte van het membraan wordt ook wel ‘brush border membrane’ of borstelzoommembraan genoemd. Het basolaterale oppervlak van de darmepitheelcellen is gespecialiseerd in diffusie van suikers en aminozuren uit de enterocyt naar de extracelullaire ruimte.

Fig.4 Door vergroting van het oppervlak verhoogt de absorptiecapaciteit van het darmepitheel.

4.2.2. Absorptie van monosacchariden in de dunne darm.

Suikers zijn de voornaamste energiebron in alle fasen van het leven van zoogdieren. De suikers die in het voedsel aanwezig zijn (lactose, zetmeel,…) worden afgebroken tot monosacchariden door amylasen uit het speeksel en pancreassap en door disaccharidasen in de glycocalyx. Bij het transepitheliale transport van stoffen maken we onderscheid in transport dóór de cel (transcellulair) en transport lángs de cel (paracellulair). Het is aangetoond dat glucosetransport over het darmepitheel een actieve en een passieve component heeft (Debnam en Levin, 1975).

4.2.2.1. Actief glucosetransport

Transcellulair transport gebeurt altijd in twee stappen. Nutriënten worden door volgroeide enterocyten aan de top van de darmvilli opgenomen. In een tweede stap gaan de monosacchariden van het cytoplasma van de enterocyt naar de extracellulaire ruimte om uiteindelijk in het bloed opgenomen te worden.

Glucose en galactose worden, tegen hun concentratiegradiënt in, over het borstelzoom-membraan getransporteerd door de Na⁺/suiker co-transporter, (‘Sodium Glucose Linked Transporter1’ SGLT1). Met elk molecule glucose dat SGLT1 in de enterocyt binnenbrengt, komen twee Na⁺-ionen mee. Om de stijging van de osmolariteit te compenseren diffunderen ongeveer 1100 moleculen water door het membraan er per molecule glucose. Voor efficiënte opname van water is actief transport van osmolieten noodzakelijk.

SGLT1 transporteert glucose en Na⁺-ionen volgens een ‘alternating access’ mechanisme. Eerst binden twee natriumionen aan het extracellulaire gebied van SGLT1, waardoor de conformatie zodanig verandert dat glucose of galactose kan binden. Dan worden de twee Na⁺ en het suikermolecule over het membraan getransporteerd door middel van een andere conformatieverandering (gecoördineerde rotatie en/of ‘tilt’ van de transmembraanhelices). Glucose wordt dan eerst losgelaten in het cytoplasma en daarna de twee Na⁺. Dit wordt bevorderd door de lage affiniteit van de cytoplasmatische glucose/galactose bindingsplaats en de lage intracellulaire concentratie aan natriumionen. De ligand-vrije transporter relaxeert dan terug tot de conformatie waarbij de bindingsplaatsen naar buiten gericht zijn. Elke transporter doorloopt deze cyclus ongeveer 1000 keer per seconde bij 37°C. (Wright et al., 2003) Dit proces is energetisch mogelijk doordat het 3Na⁺/2K⁺ -ATPase natriumionen over het basolaterale membraan uit de cel pompt (verbruik van ATP) en een Na⁺-gradiënt veroorzaakt. Transport van monosacchariden doorheen het borstelzoommembraan is dus een secundair actief proces. De binnengepompte kaliumionen diffunderen terug naar buiten door een K⁺ -kanaal, waardoor een binnenkant-negatieve potentiaal ontstaat. SGLT1 transporteert per glucose twee Na⁺-ionen, waardoor het epitheel van de dunne darm in staat is glucose te transporteren tegen een heel grote concentratiegradiënt. Bij evenwicht van SGLT1 is de intracellulaire glucoseconcentratie 30000 maal groter dan de glucoseconcentratie van de darminhoud. Fructose wordt passief opgenomen uit de darminhoud, GLUT5 faciliteert de diffusie van fructose over de borstelzoom. Eenmaal geabsorbeerd, worden galactose en fructose meestal omgezet in glucose-6-fosfaat voor opname in het metabolisme.

Voor de tweede transportstap is geen energie vereist, GLUT2 faciliteert diffusie van glucose, galactose en fructose over het basolaterale membraan. De glucosecarrier GLUT2 heeft twaalf transmembraandomeinen, het bindt glucose aan de ene kant van het membraan en laat het los aan de andere kant. Transport van glucose gebeurt in beide richtingen, dit is noodzakelijk om de epitheelcellen van glucose te voorzien bij een suikervrij diëet. Het netto-transport van glucose gebeurt altijd in de richting van de glucose-gradient. GLUT2 valt dus te vergelijken met een kanaal voor glucose, waardoor een evenwicht kan ontstaan van de glucoseconcentraties in de compartimenten die door het membraan gescheiden worden.

De gegevens van Stümpel et al. (2001) suggereren een alternatief mechanisme waarbij fosforylatie van glucose en transport naar het endoplasmatisch reticulum noodzakelijk zijn voor de export uit de enterocyten. Als GLUT2 niet aanwezig is, wordt glucose nog wel over het basolaterale membraan getransporteerd, maar dit wordt verhinderd door glucose-6-fosfaat translocase inhibitoren. Het suiker wordt dan door middel van exocytose naar het extracellulair vocht gebracht.

Fig.5: Mechanisme van het (secundair) actief glucosetransport over het darmepitheel

4.2.2.2. Passief glucosetransport.

De laatste vijftien jaar heeft zich een debat ontwikkeld over het mechanisme van de passieve component van glucose-absorptie in de darm. Pappenheimer en Reiss (1987) stelden voor dat ‘paracellular solvent drag’ bijdraagt aan een passieve component van het glucosetransport, die bij hoge glucoseconcentraties groter is dan de SGLT1-gemediëerde actieve component. Deze hypothese houdt in dat opgeloste nutriënten uit de darm worden opgenomen door de osmotische flux van water doorheen de poriën van de dichte juncties. Het ‘openen’ van de dichte juncties is afhankelijk van Na⁺/nutriënt cotransport.

Helliwell en Kellett (2000) spreken de hypothese van Pappenheimer tegen en tonen aan dat de passieve component van het glucosetransport te wijten is aan transport door GLUT2 over het borstelzoommembraan. GLUT2 is daar niet constitutief aanwezig, maar wordt door actief glucosetransport geïnduceerd. Studies met phloretine en phloredzine, specifieke inhibitoren van respectievelijk GLUT2 en SGLT1, tonen aan dat GLUT2 een aanzienlijk aandeel heeft in de glucose-absorptie, bij hoge glucoseconcentraties aan de lumenale zijde van het borstelzoommembraan. (Fig.6) (Kellett, 2001)

Fig6. : Het aandeel van glucosetransporters SGLT1 en GLUT2 in de totale absorptie van glucose over het darmepitheel. ▲: Phloretine-ongevoelig: SGLT1; ●: Phlorezine-ongevoelig: GLUT2; ■: glucosetransport zonder inhibitoren. (Kellett, 2001)

4.2.3. Glucose-sensing in de zoogdierdarm

De darmepitheelcellen worden voortdurend blootgesteld aan sterke variaties in de concentraties van monosacchariden. Dit in tegenstelling tot de meeste andere zoogdiercellen, die baden in een intern medium met een glucoseconcentratie die door endocriene werking constant wordt gehouden. Het is essentieel dat de zoogdierdarmcellen de glucoseconcentraties in de darm snel waarnemen en zich eraan aanpassen. Het is aangetoond dat monosacchariden in het lumen van de darm van een brede groep van diersoorten een regulerend effect hebben op de activiteit van de transporters, vergelijkbaar met wat in gistcellen is waargenomen.

De dunne darm van herkauwers (ruminantia), is een uniek modelsysteem voor studies op de regulatie van SGLT1. In het verteringsstelsel van een zogend lam is het rumen nog niet ontwikkeld, en is er ook geen ruminale microflora. Alle suikers uit de melk worden bijgevolg opgenomen in de dunne darm. Het rumen ontwikkelt zich als het diëet verandert van melk naar gras, bij het spenen. De ruminale microflora fermenteert cellulose en andere opgenomen suikers tot vluchtige vetzuren, waardoor praktisch geen glucose of galactose nog de dunne darm bereikt. De vluchtige vetzuren worden opgenomen en in de lever gebruikt voor gluconeogenese. De overgang van het zogend (pre-ruminant) stadium naar het gras-etend (ruminant) stadium brengt een dramatische daling teweeg in de hoeveelheid en de activiteit van het SGLT1 proteïne en dit is het directe gevolg van de sterke terugval van de glucose-concentratie in het darmlumen. Rechtstreeks toedienen van glucose, galactose, fructose, α-methyl –D-glucose en 3-O-methyl-D-glucose in de dunne darm van een volwassen schaap (m.b.v. een duodenale canule) zorgde voor een verhoogde expressie van SGLT1, tot het expressieniveau van een pre-ruminant lam. Op dezelfde wijze toonde men aan dat ook suikers die geen substraat zijn voor SGLT1 (2-deoxy-D-glucose) en niet metaboliseerbare glucose-analogen (methyl-α-D-glucopyranoside en 3-O-methyl-α,D-glucopyranoside) de expressie van SGLT1 activeren. Het kunstmatig verlengen van het melkdieet stelde de daling van het aantal transporters uit. (Shirazi-Beechey et al., 1991)

Om te achterhalen of glucose moet getransporteerd worden om SGLT1 te induceren werd een wateroplosbare, metabolisch inerte, en membraan-impermeabel glucose-analoog gesynthetiseerd: twee glucosemoleculen worden met koolstof 6 gebonden aan de wateroplosbare en door zijn grootte ontransporteerbare polymeer Poly (Ethyleen Glycol)₆₀₀ (PEG₆₀₀). De structuur en stabiliteit van de macromolecule en de afwezigheid van vrij glucose in de oplossing werd bevestigd door fysische, chemische en enzymatische analyses. De infusie van di(glucose-6-yl)PEG₆₀₀ in de dunne darm van het schaap leidt tot de inductie van functioneel SGLT1 in het apicale membraan van de enterocyten. Infusie van PEG₆₀₀. veroorzaakt dit niet. Deze gegevens tonen aan dat glucose in het lumen wordt gedetecteerd door een glucosereceptor aan de externe zijde van het borstelzoom-membraan van de darmepitheelcellen (Dyer et al., 2003). De bindingsplaats heeft een suikerspecificiteit verschillend van SGLT1 en binding brengt een intracellulair signaal voort dat onafhankelijk van het glucosemetabolisme leidt tot de activering van SGLT1 gentranscriptie.

Om de mechanismen die betrokken zijn in de suiker-geïnduceerde expressie van SGLT1 te achterhalen, werden verschillende in vitro systemen onderzocht. De muis entero-endocriene cellijn STC-1 is een zeer geschikt systeem. Deze cellen vormen in cultuur een gepolariseerd epitheel met dichte juncties. De STC-1 cellijn vertoont dezelfde glucose-responsiviteit als natieve enterocyten. De abundantie van het SGLT1 proteïne verhoogt sterk bij toevoegen van glucose aan het medium. (Dyer et al., 1997b) De LLC- PK₁ cellijn is afgeleid van de epitheelcellen van de proximale tubulus van de varkensnier. De regulatie van SGLT1 in niercellen gelijkt op die van enterocyten en STC-1 cellen. Peng en Lever (1995) namen in de LLC-PK₁ cellijn een grote, cAMP afhankelijke stijging van de expressie van SGLT1 waar, zoals in enterocyten en STC-1 cellen. De Caco-2 cellijn is een veelgebruikt in vitro modelsysteem dat afgeleid is van humane colon-adenocarcinoma cellen, die veel eigenschappen van volgroeide enterocyten vertonen. Deze cellen zijn een waardevol modelsysteem voor studies op de functie en differentiatie van darmcellen.

Dyer et al. (2003) toonden aan dat de cAMP-concentratie in STC-1 cellen 32% steeg als de cellen van een medium met 5mM glucose overgebracht werden in een medium met 25 mM glucose. Bij additie van de PKA-agonist 8-Br-cAMP aan celculturen met lage glucose-concentratie, steeg de expressie van SGLT1 ongeveer evenveel als bij blootstelling aan 25 mM glucose. Ook in schapendarm veroorzaakte infusie van 8-Br-cAMP stimulering van de SGLT1 promoteractiviteit. De PKA-inhibitor, H-89, deed in beide celtypes de glucose-geïnduceerde stijging van SGLT1 teniet. Deze data stroken ook met de waarnemingen in de LLC-PK₁ cellijn. (Loflin en Lever, 2001)

Al deze gegevens ondersteunen het bestaan van een G-proteïne-gekoppelde-receptor (GPCR) voor glucose, gekoppeld aan een G-proteïne dat adenylaat cyclase activeert in het apicale membraan van de enterocyten. De activiteit van cAMP afhankelijk proteïne kinase (PKA) stimuleert dan de expressie van de SGLT1 glucose transporters. Het is in het belang van het organisme dat deze receptor door lage glucoseconcentraties wordt geactiveerd. Het achterhalen van de componenten van deze signaalweg zou een doorbraak zijn in het onderzoek naar de nutriënt-sensing mechanismen van de eukaryote cel.

Hirsch et al. (1996) gebruikten Xenopus oöcyten waarin het konijnen SGLT1 gen tot expressie werd gebracht om de regulatie te bestuderen. Bij activatie van PKA, door toevoegen van 8-Br-cAMP, namen ze een stijging in het glucosetransport waar van 30%. Activatie van Ca²⁺ afhankelijk proteïne kinase PKC, door toevoegen van sn-1,2-dioctanoylglycerol (DOG), deed de activiteit van SGLT1 60% dalen. Clancey en Lever (2000) tonen ook in de LLC-PK1 cellijn aan dat PKC en PKA tegenovergestelde effecten hebben op de hoeveelheid SGLT1 in het borstelzoommembraan.

4.2.4. Regulatie van de hoeveelheid SGLT1-transporters in het borstelzoommembraan

4.2.4.1. Transcriptie

Lescale-Matys et al. namen in 1993 waar dat Glucose-geïnduceerde expressie van SGLT1 in het schapendarmepitheel slechts gedeeltelijk te wijten is aan verhoogde transcriptie. Het SGLT1 gen wordt ongeveer vier maal meer overgeschreven naar mRNA als respons op een verhoogde luminale suikerconcentratie.

Vayro et al., (2001) onderzochten het promotergebied van SGLT1 en toonden aan dat een gebied dat overeenkomt met het HNF-1 consensus bindingsdomein noodzakelijk is voor glucose-responsiviteit van transcriptie. Er is tevens een gecorreleerde daling van de hoeveelheid HNF-1 (hepatic nuclear factor-1) en SGLT1 mRNA in de darmepitheelcellen, bij overgang van het pre-ruminante naar het ruminante stadium en een overeenkomstige stijging bij glucose-infusie van de dunne darm van volwassen schapen. Binding van HNF-1 op de promotersequentie van SGLT1 in vitro werd aangetoond aan de hand van DNA mobiliteits-shift experimenten. HNF-1 werkt dus vermoedelijk als transcriptie-activator van SGLT1 en komt tot expressie als glucose gedetecteerd wordt in de dunne darm. In celkernen van glucose-geïnfuseerde schapendarmepitheelcellen werd twee tot driemaal zoveel nieuw gesynthetiseerd SGLT1 mRNA gevonden als in niet-geïnfuseerde controledieren. Verhoogde transcriptie alleen kan niet verantwoordelijk zijn voor de meer dan vijftigvoudige verhoging van het intacte SGLT1 mRNA die gedetecteerd werd door Northern-blot analyse van mucosale schraapsels uit het jejunum, waarin cytoplasmatisch RNA aanwezig is. De belangrijkste regulatie van SGLT1 gebeurt dus post-transcriptioneel.

4.2.4.2. mRNA stabiliteit

Loflin en Lever (2001) toonden aan dat HuR (Humaan antigen R) bindt aan een uridine rijk element van 47 ribonucleotiden in het 3’ onvertaalde deel van het SGLT1 mRNA in LLC-PK₁ cellen. HuR is een RNA bindend proteïne, gekend voor zijn stabilizerende werking op uridine rijke sequenties. Een AU Rijk Element (ARE) in het 3’ onvertaalde gedeelte van een mRNA is een cis element dat snelle degradatie bevordert

Een belangrijke eigenschap van HuR is dat het tussen de nucleus en het cytoplasma pendelt (Fan en Steitz, 1998). Recent is een specifiek endo(ribo)nuclease ontdekt dat uridine-rijke mRNA sequenties splitst (het trans-element), waardoor het RNA snel afgebroken wordt door exonucleasen (Zhao et al., 2000). HuR zou dus, door binding in de buurt van de endonuclease herkenningsplaats, het SGLT1 mRNA onbeschikbaar maken voor endonucleolytische activiteit tijdens de verplaatsing van de celkern naar de ribosomen op het ruw endoplasmatisch reticulum.

Met behulp van de fosfodiësterase-inhibitor IBMX kon men in de LLC-PK₁ cellen waarnemen dat er bij verhoogde cAMP-concentratie meer HuR aan de URE van SGLT1 mRNA bindt. Fosfatasewerking op een extract van celkernen van met IBMX behandelde cellen doet de binding van HuR aan het uridine-rijk element afnemen. (Loflin en Lever, 2001) Dit betekent dat de stabilisatie van het mRNA afhankelijk is van fosforylatie van één of meerdere cellulaire proteïnen. Men vermoedt dus activatie door de cAMP-PKA fosforylatiecascade

De aanwezigheid van HuR in de darm van muizen is aangetoond door Lu en Schneider (2004). Muis en mens SGLT1 mRNA bevatten beiden twee AUUUA sequenties in het 3’ onvertaalde uiteinde, gekend als bindingsplaats voor HuR. Wat gekend is van de sequentie van het schaap SGLT1 mRNA (Tarpey, 1995) heeft slechts een kort 3’ onvertaald gedeelte, dat geen uridine rijke elementen bevat. Het is mogelijk dat regulatie op het niveau van RNA-stabiliteit niet aanwezig is in het schaap, dan moet de regulatie van het glucosetransport in de schapennier ook verschillen van het mechanisme in de varkensnier, of althans van het mechanisme in de LLC-PK1 cellijn.

4.2.4.3. Vesikeltransport

Wright et al. stelden in 1997 vast dat activatie van PKA en PKC geen verandering in de kinetische eigenschappen van de SGLT1 transporter induceert en dat regulatie te wijten is aan een gewijzigd aantal transporters in het membraan. Zij onderzochten korte-termijneffecten geïnduceerd door stimulatie van PKA en PKC op de abundantie van SGLT1 transporters in het membraan van Xenopus oöcyten die humaan SGLT1 tot expressie brengen en stelden regulatie ter hoogte van vesikeltransport vast. Zij vonden ook consensus fosforylatiesites voor PKA en PKC op de intracellulaire lussen van de transporter.

In 2003 toonden Wright et al. aan dat de recessieve afwijking ‘glucose-galactose malabsorption’ (GGM), waardoor de patient diarree heeft zolang er glucose of galactose in het dieet zit, te wijten is aan een mutatie in het SGLT1 gen. Ze stelden vast dat de suikertransporters wel aangemaakt worden, maar het plasmamembraan niet bereiken. Er is dus een verstoorde regulatie ter hoogte van het vesikeltransport, die afhankelijk is van de aminozuursequentie van SGLT1 zelf. Het feit dat glucose in de darm van patiënten met GGM de absorptie van andere nutriënten en water verstoort, is een aanwijzing dat de aanwezigheid van glucose een receptor stimuleert op het borstelzoommembraan. Het intracellulaire signaal van deze receptor maakt dat de cellen in de eerste plaats glucose willen opnemen, ten koste van het transport van andere nutriënten.

Kipp et al. (2003) toonden in de Caco-2 cellijn aan dat zich dubbel zoveel transporters op intracellulaire vesikels bevinden dan op het plasmamembraan. Immunocytochemische kleuringen toonden aan dat vesikels geladen met SGLT1, geassocieerd zijn met het cytoskelet en dat exocytose en endocytose gebeurt onafhankelijk van organellen die instaan voor het centrale proteïne synthese/degradatie traject. (Fig.7)

Fig.7 Intracellulaire vesikels met SGLT1 zijn geassocieerd met microtubuli in de Caco-2 cellijn. (Kipp et al., 2003)

Recente studies (Veyhl et al., 2003) op Xenopus oöcyten die humaan SGLT1 tot expressie brengen, tonen aan dat PKC en dynamine betrokken zijn in het inhiberende effect van het regulatorisch proteïne RS1 op de expressie van SGLT1. Dynamine is een GTP-ase dat onder andere betrokken is in de voltooiing van endocytose. Als RS1 niet aanwezig is zorgt activatie van PKC voor stimulatie van exocytose van humaan SGLT1. Een activator van PKC (leptine) inhibeert galactose-absorptie en een PKC-inhibitor (chelerythrine) gaat dit effect tegen. (Barrenetxe et al., 2004)

Fig.8: De regulatie van de hoeveelheid SGLT1 gebeurt op verschillende niveaus: transcriptie (aangetoond in de STC-1 cellijn, Vayro et al., 2001), mRNA stabiliteit (aangetoond in de LLC-PK₁ cellijn, Loflin en Lever, 2001) en vesikeltransport (aangetoond in getransfecteerde Xenopus oöcyten, Wright et al., 1997 en de Caco-2 cellijn, Kipp et al., 2003)

4.2.4.4. Een verband tussen het regulatiemechanisme en het onderzochte organisme.

Het menselijke eetgedrag vereist van de darm dat ze op korte tijd veel voedingsstoffen opneemt. De korte-termijn verhoging van het aantal transporters in het membraan is waarschijnlijk te wijten aan versnelde exocytose van vesikels verzadigd met transporters. Voor blijvende veranderingen, zoals de ontwikkeling van het rumen bij herkauwers, gebeurt de regulatie ter hoogte van transcriptie. De fermentatie door de rumenale microflora verhindert dat suikers de darm bereiken, ook als een volwassen schaap terug zou beginnen zogen. Een snelle respons op glucose is in deze dieren dus veel minder belangrijk. Hoewel de regulatiemechanismen van SGLT1 zich op een verschillend niveau afspelen in verschillende weefsels en organismen, zijn ze allemaal afhankelijk van PKA. Het is dus mogelijk dat alle glucose-geïnduceerde mechanismen door dezelfde geconserveerde receptor voor glucose gemedieerd worden.

4.2.5. De rol van PKC in glucose-sensing

Hoewel de ‘paracellular solvent drag’ hypothese van Pappenheimer en Reiss (1987) voor passieve opname van glucose in de darm lange tijd veel bijval heeft gekend, tonen de gegevens van Kellet en Helliwel (2000) aan dat GLUT2 verantwoordelijk is voor de stijging van de transportsnelheid van glucose boven de verzadigingsgraad van SGLT1. De activiteit van SGLT1 verhoogt de hoeveelheid competent PKC βII isozyme, onafhankelijk van Ca²⁺ en ook de MAPK (mitogen activated proteïn kinase) signaalweg is hierbij betrokken. Omdat ook mannitol dit effect veroorzaakt maar niet wordt getransporteerd, suggereren deze onderzoekers dat er zich mogelijk een specifieke receptor voor glucose in het borstelzoommembraan bevindt. Deze receptor zou dan via een Ca²⁺-signaal competent PKC βII activeren om het aantal GLUT2 transporters te verhogen. (Helliwell et al., 2003). Zij vermoeden een rol voor het niet transporterende lid van de Na+ -cotransporters, SGLT3. Diez-Sampedro et al. (2003) toonden echter aan dat dit proteïne niet in enterocyten tot expressie komt. Een glucose-geactiveerd GPCR-systeem is een andere mogelijkheid. Het is dus mogelijk dat er zich twee GPCR’s voor glucose in het borstelzoommembraan bevinden. (Fig. 9)

Fig.9: Hypothese omtrent de rol van glucose-geactiveerde GPCR-systemen in de regulatie van suikertransport. Bij detectie van glucose in de darm wordt het actief transport geactiveerd via de cAMP-PKA signaalweg. Als er echter hoge glucose-concentraties (meer dan 50 mM) worden gedetecteerd medieert PKC de activatie van het gefaciliteerde transport, door verhoging van het aantal GLUT2 transporters in het borstelzoommembraan. Samengesteld aan de hand van gegevens uit Dyer et al., 2003 en Helliwell et al., 2003

Deze waargenomen activatie van het gefaciliteerd transport zorgt niet voor een vermindering van de actieve component van het glucosetransport (Kellet, 2001). Het inhiberende effect van PKC op SGLT1 waargenomen door Hirsch et al. komt hiermee niet overeen. Een mogelijke uitleg is dat de detectie van een nutriënt verschillend van glucose, een Ca²⁺-signaal induceert in de enterocyten. In afwezigheid van actief glucosetransport, leidt dit tot de vermindering van het aantal SGLT1 transporters en een verhoging van het aantal transporters voor dat bepaalde nutriënt. In de STC-1 cellijn zorgt de detectie van aggregaten van lange-keten vetzuren bijvoorbeeld voor een verhoging van de intracellulaire Ca²⁺-concentratie in een signaalweg die leidt tot secretie van cholecystokinine, een stof die de afgave van galzouten bevordert (Benson et al., 2002).

Doelstellingen

Het ultieme doel van dit project is het gen te identificeren dat codeert voor de G-proteïne gekoppelde receptor (GPCR) die verantwoordelijk is voor het suiker-sensing mechanisme dat de inductie medieert van de Na⁺/glucose cotransporter SGLT1. De doelstelling van mijn thesisonderzoek is de structurele screening van de epitheelcellen: de GPCR’s identificeren die in het darmepitheel van de muis tot expressie komen, aan de hand van PCR- en hybridisatie-gebaseerde technieken. Op die manier bekomen we een verzameling van genen voor GPCR’s waartussen zich de glucosesensor kan bevinden.

Structurele screening wordt uitgevoerd met behulp van DOP-PCR amplificatie van mRNA uit darmepitheelcellen van muizen. Dit is PCR met gedegenereerde primers, gebaseerd op alignering van geconserveerde sequenties die overeenkomen met transmembraandomeinen van gekende GPCR’s, waarna de sequentie van het PCR-product wordt bepaald. Anderzijds wordt ook met RT-PCR naar gekende weesreceptoren gezocht in het mRNA uit de epitheelcellen van de dunne darm van de muis.

Een andere benadering bestaat uit de analyse van een micro-array, die heel wat genen voor GPCR’s bevat en onderworpen werd aan hybridisatie met mRNA dat uit STC-1-cellen geïsoleerd werd. De aanwezigheid van de weesreceptoren die op de micro-array een signaal gaven wordt dan getest door RT-PCR op het RNA dat uit de dunne darm van muizen werd geïsoleerd.

Door Q-PCR en micro-array analyse van het RNA van STC-1 celculturen die in media met verschillende glucose-concentraties zijn opgekweekt, kunnen eventuele verschillen in expressie aangetoond worden. Dit kan een eerste aanwijzing zijn voor de functie van receptorgenen.

In de verdere stappen van dit project zullen de kandidaat-glucosereceptors het onderwerp zijn van functionele screening. Enerzijds kan men in een gist-systeem achterhalen of de expressie van één van de kandidaten het groeidefect van de gpr1Δ sch9Δ stam kan opheffen en nagaan of dit afhankelijk is van de aanwezigheid van glucose. Men kan ook nagaan of één van de GPCR’s in staat is cAMP synthese te activeren als respons op het toevoegen van glucose. De laatste doelstelling zal zijn om de activiteit van de receptor in muizencellen aan te tonen met behulp van RNAi en kameelantilichamen. Functionele screening behoort echter niet tot de doelstellingen van mijn thesisonderzoek.

Voor de functionele screening is het volledige coderende gebied van de receptor-mRNA’s nodig, geflankeerd door restrictieplaatsen die directionele klonering in een expressievector mogelijk maken. Dit gebeurt door RT-PCR met primers die het volledige coderende gebied van het mRNA amplificeren en aan het 5’ einde een sequentie bevatten die niet met het mRNA basepaart, maar een restrictie-knipplaats aan het PCR-product toevoegt.

Materiaal en methoden

1. RNA

Isolatie en zuivering van RNA uit darmepitheelcellen werd door Jane Dyer uitgevoerd aan de universiteit van Liverpool, met gebruik van de RNeasy Mini Kit van Qiagen, gevolgd door DNase-behandeling. De stalen waren afkomstig uit het duodenum, jejunum en ileum van de muizendarm. Ook uit STC-1 cellen werd het RNA geïsoleerd, enerzijds uit een celcultuur die op 5 mM glucose werd opgekweekt, anderzijds uit een celcultuur die 25 mM glucose bevatte. Details over de isolatie van het RNA zijn te vinden in het artikel van Vayro et al. (2001).

2. cDNA synthese

cDNA kan aangemaakt worden door het enzyme Reverse Transcriptase. Dit enzyme maakt DNA aan op basis van RNA en vertoont een hoge stabiliteit bij temperaturen hoger dan 50°C. Het opgezuiverde mRNA wordt naar cDNA vertaald. Er wordt hierbij gebruik gemaakt van oligo(dT) primers die aan de polyA-staarten van de mRNA’s binden. Na de RT-reactie wordt RNAse H toegevoegd om het mRNA af te breken. In eerste instantie werd het RNA van de drie gedeelte van de dunne darm apart omgezet naar cDNA en onderworpen aan PCR. Om sneller en goedkoper te werken werden daarna gelijke hoeveelheden RNA uit duodenum, jejunum en ileum samengevoegd.

Fig. 1: cDNA synthese

2.1. Materiaal (Thermoscript™ RT kit, invitrogen)

- mRNA

- 50 µM oligo(dT)₂₀

- 10 mM dNTP mix: 10mM Adenosine, 10 mM Guanosine, 10 mM Cytosine,

   10 mM Thymidine

- Thermoscript™ Reverse Transcriptase (15 U/µl)

- 5x cDNA synthese buffer: 250 mM Tris acetaat (pH 8.4), 375 mM Kalium acetaat,

   40 mM magnesiumacetaat

- 0.1 M dithiothreitol (DTT)

- RNaseOUT™ (50 U/µl): RNase-inhibitor

- E coli RNase H (2 U/µl)

- DEPC-behandeld water

2.2. Methode

- Pipeteer 2 µg RNA in een microcentrifugeerbuisje op ijs.

- Voeg 1 µl oligo(dT) oplossing toe.

- Voeg 2 µl dNTP-mix toe.

- Vul aan met DEPC-water tot 12 µl.

- Plaats 5 minuten op 65 °C en daarna terug op ijs.

- Bereid een reactiemengsel voor de RT-reactie op ijs, 8 µl per reactie bestaande uit:

            - 4 µl cDNA syntesebuffer (5x)

            - 1 µl DTT

            - 1 µl RNase OUT

            - 1 µl ThermoscriptRT

- Voeg 8 µl reactiemengsel bij de 12 µl oligo(dT)-primed RNA.

- Plaats 1 uur op 65°C en 5 minuten op 85 °C.

- Voeg 1 µl RNase H toe

- Plaats 20 minuten op 37 °C en 10 minuten op 65 °C

- Voeg 60 µl MilliQ-water toe.

- Bewaar het cDNA op -20 °C.

3. PCR

3.1. algemeen

De Polymerase Chain Reaction is een techniek waarbij een stuk DNA in vitro wordt geamplificeerd. Er wordt hierbij gebruik gemaakt van het enzyme Taq polymerase. Primers zijn oligonucleotiden die complementair zijn met sequenties van hetzelfde gen, en die bij binding een initiatieplaats vormen voor DNA-Polymerase. Het Taq Polymerase is afkomstig van Thermus aquaticus, een bacterie die leeft in warmwaterbronnen en beschikt over hittebestendige enzymen. Taq Polymerase is optimaal actief bij 72°C en verliest zijn werking niet bij zeer hoge temperaturen.

PCR gebeurt in drie stappen die samen één cyclus vormen. In een eerste stap (denaturatie), wordt het DNA gedenatureerd, de waterstofbruggen tussen de basen van de twee DNA strengen worden verbroken door de hoge temperatuur. Bij 95 °C komt enkel nog enkelstrengig DNA voor. De tweede stap (annealing) stap, laat hybridisatie van de primers met het enkelstrengig DNA toe. De temperatuur tijdens deze stap is minstens 2 graden lager dan de smelttemperatuur van de primers (Tm). Onder invloed van het Taq polymerase zullen in de derde stap (elongatie) de gehybriseerde primers verlengd worden. Zo worden de nieuwe complementaire strengen aangemaakt. Het polymerase werkt in de 5’ → 3’ richting. Deoxynucleoside-5’-trifosfaten (dNTP’s) worden aangehecht aan het 3’ uiteinde van de (verlengde) primer waarbij twee fosfaatgroepen worden afgesplitst. De derde stap gebeurt bij 72 of 68 °C, naargelang het gebruikte enzyme. De kopies van beide DNA strengen en de beide strengen zelf worden als templaat gebruikt voor een volgende amplificatieronde. Alleen als aan beide complementaire strengen een primer bindt, en het 3’ uiteinde van de ene primer in de richting van de andere primer wijst is exponentiele amplificatie mogelijk. Deze cyclus wordt meestal 35 maal doorlopen. Minder cycli betekent minder amplificatie, meer cycli vergroot de kans op fouten in het replicatieproces.

De duur van de verschillende stappen hangt af van het DNA polymerase en de lengte van het amplicon. De eerste denaturatiestap duurt langer dan de andere denaturatiestappen om het cDNA volledig te denatureren. De laatste elongatiestap wordt ook vaak verlengd, opdat alle strengen afgewerkt zouden worden en zodat elk dubbelstrengig PCR product een 3’ afhangend adenosine-residu heeft, ten gevolge van de Terminaal-Transferase-activiteit van Taq Polymerase.

Fig. 2 : PCR op basis van cDNA

3.1.1. Materiaal

- cDNA

- primers: 10 µM werkoplossing.

- 10 mM dNTP mix: 10mM Adenosine, 10 mM Guanosine, 10 mM Cytosine,

   10 mM Thymidine

- 10x PCR buffer

- 50 mM MgSO₄

- Platinum® Taq Polymerase

- Thermocycler Westburg

3.1.2. Methode