I N L E I D I N G

Op wereldschaal vormen fibrotische leverziekten een belangrijk probleem in de gezondheidszorg. Leverfibrose leidt tot cirrose, en dit met de dood tot gevolg indien geen levertransplantatie wordt toegepast. In België alleen al sterven jaarlijks 1500 mensen aan fibrotische leverziekten.^[1] Leverfibrose wordt niet alleen veroorzaakt door hepatitis, langdurige galstuwing en een aantal genetische leverziekten. Ook chronisch alcoholmisbruik en eiwitgebrek (bijvoorbeeld in hongergebieden) kunnen tot deze ziekte leiden.^[2]

Fibrose ontstaat na een transdifferentiatie van stellaatcellen, die in normale toestand in beperkte mate bindweefsel produceren en fungeren als vitamine A reserve voor het lichaam.^[1]

Fibrose en cirrose geven aanleiding tot ernstige leverstoornissen, geelzucht en oedeem. Als gevolg van de verschrompelde lever is de afvoer van het bloed uit de darmen bemoeilijkt. Hierdoor kunnen spataderen rond de slokdarm ontstaan die aanleiding kunnen geven tot een zeer grote en vaak dodelijke bloeding.^[2]

Op het niveau van de celkern worden fundamentele processen zoals DNA replicatie en transcriptie geregeld door de mate waarin de e-amino groepen van de lysine residu´s der nucleosomale histonen geacetyleerd zijn. Het negatief geladen DNA is door electrostatische interactie gebonden op de histon proteïnen die rijk zijn aan positief geladen lysine residu´s. Deze residu´s worden door histon acetyl transferase geacetyleerd en door histon deacetylase kunnen de acetyl groepen verwijderd worden. Het is duidelijk dat het DNA losser gebonden is op het histon naarmate meer lysine residu´s geacetyleerd zijn (hetgeen zich voordoet wanneer het histon deacetylase wordt geïnhibeerd). Dit losser gebonden DNA leent zich beter tot expressie. Histon deacetylase inhibitoren beïnvloeden dus het fenotype van de stellaatcellen door de transcriptie van welbepaalde genen te vergemakkelijken.^[1]

De actieve site van het histon deacetylase enzyme bestaat uit een hydrofobe buisvormige holte. Op de bodem bevindt zich een Zn²⁺ ion dat gecoordineerd is door 2 aspartaat residu´s, een histidine residu en een water molecule.^[3]

Uit de bacterie Streptomyces hygroscopycus heeft men Trichostatine A (1) kunnen isoleren, een stof met goede antifibrinogene eigenschappen.^[1]

Trichostatine A (1) inhibeert histon deacetylase door zijn lange alifatische keten in de hydrofobe holte te positioneren. De eindstandige hydroxamzuurfunctie bereikt aldus het polaire gedeelte van de holte waar ze met het Zn²⁺ ion coordineert in de hoedanigheid van een bidentaal ligand. Het ligand vervangt hierbij met zijn hydroxylgroep het aan zink gebonden watermolecule. De dimethylamino-benzoyl groep aan de andere kant van de alifatische keten maakt contacten met de ingang van de catalytische site.^[3]

Gezien er geen effectieve behandeling – uitgenomen orgaantransplantatie – voor leverfibrose bestaat, spitst onderzoek zich toe op het ontwikkelen van een histon deacetylase inhibitor die de activatie van de stellaatcellen verhindert. En dit temeer omdat Trichostatine A (1) niet in voldoende mate kan verkregen worden uit Streptomyces culturen.^[1] Bovendien laat de door Mori ontwikkelde asymmetrische 15 staps synthese een productie op industriele schaal niet toe.^{[1] en [4]}

Naast Trichostatine A (1) bestaat er een familie van natuurlijk voorkomende tetracyclische peptiden, waar trapoxine B (2) en apicidine (3) deel van uitmaken, die histon deacetylase eveneens sterk inhiberen. Waar Trichostatine A (1) zijn antifibrogene werking reeds laat zien in het submicromolaire concentratiedomein (10^-7 – 10^-8 M), zijn de cyclische tetrapeptiden actief in het nanomolaire concentratiedomein.^[1] Deze moleculen bestaan uit delen die functioneel equivalent zijn met de zinkchelator, de dimethylamino-benzoyl groep en de alifatische keten van Trichostatine A (1).^[3]

In de plaats van een hydroxamzuur heeft trapoxine (2) een reactieve a-ketoepoxide functie waarop een nucleofiel uit de actieve site kan aanvallen zodat het enzyme irreversibel geïnhibeerd wordt.^[3]

Apicidine (3) is het enige cyclische tetrapeptide met een ethylketon functie in de zijketen die activiteit vertoont.^[1] Het ethylketon kan in interactie treden met de polaire residu´s van de actieve site, en waarschijnlijk met zink.^[3]

Trapoxine (2) en apicidine (3) hebben in plaats van een dimethylamino-benzoyl groep een cyclisch tetrapeptide, met hydrofobe groepen zoals (S)-fenylalanine en (R)-proline, dat als een kap de ingang van de catalytische site kan bedekken. In vergelijking met de dimethylamino-benzoyl groep van Trichostatine A valt op te merken dat de peptidering door zijn omvang meer uitgebreide contacten kan maken met de ingang.^[3]

Aangezien een diketopiperazine eenvoudiger te synthetiseren is dan een cyclisch tetrapeptide, kan men onderzoeken of cyclische dipeptiden zoals cyclo[Lys(CONHOH)-Phe] (4) een nieuwe klasse inhibitoren vormen en of ze de antifibrinogene werking van tetracyclische peptiden evenaren.

D O E L S T E L L I N G

Het doel van deze thesis omvat de synthese van een nieuwe klasse histon deacetylase inhibitoren, met name diketopiperazine derivaten.

Bedenkende dat het te inhiberen enzyme als biologische functie heeft acetylaminobutyl groepen te herkennen en de verwijdering van de acetylgroepen door hydrolyse van de amide binding te katalyseren, zullen we ervoor opteren (S)-lysine te gebruiken als brug tussen de kap en de zink chelator van de inhibitor (5).

In de kapstructuur van tetracyclische inhibitoren (2 en 3) ligt tegenover de gefunctio-naliseerde alifatische zijketen met (S)-configuratie steeds een hydrofoob residu met (S)-configuratie (zoals (S)-fenylalanine bij trapoxine (2)). Daarom stellen we een diketopiperazine (6), opgebouwd uit de aminozuren (S)-lysine en (S)-fenylalanine, voor als precursor.

Teneinde inhibitoren te bekomen derivatiseren we de e-amino groep van lysine in functionele groepen die Zn²⁺ bidentaal kunnen complexeren.

Daarom wijzigen we de amino groep van de lysine zijketen als volgt:

Om een derivaat te verkrijgen dat functioneel equivalent is aan het hydroxamzuur in Trichostatine A (1), synthetiseren we een N-(hydroxyureum) (4). De liganden die zorgen voor de interactie zijn de carbonyl groep van het ureum en de N-(hydroxy) groep.^[15]

Bij de synthese van een tweede inhibitor, koppelt men hydroxyazijnzuur aan de lysine keten. Formeel vervangen we dus de NH in het aan lysine gelinkte hydroxamzuur door een methyleen groep. Men verwacht dat zink bidentaal gecoordineerd zal worden door de

N-(hydroxyacetyl) functie (14).^[12]

S Y N T H E S E S T R A T E G I E

5.1 Synthese van het cyclisch dipeptide

Als precursor van de verschillende histon deacetylase inhibitoren wordt cyclo[Lys-Phe] (12) gesynthetiseerd volgens schema I. In een eerste stap wordt (S)-fenylalanine (7) omgezet in zijn methyl ester (8). Vervolgens koppelt men Phe-OMe.HCl (8) aan Boc-Lys(Z)-OH (9) door het amino beschermd aminozuur (9) te activeren met TBTU. Hierna wordt de Boc beschermgroep afgesplitst door reactie met mierezuur. Het aldus ontstane dipeptide ester formaat cycliseert ter vorming van het overeenstemmende diketopiperazine (11) indien men het formaat zout refluxeert in 2-butanol / tolueen. Vooraleer tot de derivatisering over te gaan, wordt de Z groep in cyclo[Lys(Z)-Phe] (11) afgesplitst door een katalytische hydrogenolyse uit te voeren in glaciaal azijnzuur.

5.2 Derivatisering (Schema II)

Het N-(hydroxyacetyl) analoog

De e-amino groep van de lysine zijketen wordt geacyleerd met benzyloxyacetyl chloride. Hydrogenolytische afsplitsing van de benzyl groep levert cyclo[Lys(COCH₂OH)-Phe] (14).

Het N-(hydroxyureum) analoog

Men converteert cyclo[Lys-Phe] (12) in zijn isocyanaat en additie van

O-benzylhydroxylamine geeft cyclo[Lys(CONHOBzl)-Phe] (15). Na benzyl ontscherming door hydrogenolyse, bekomt men de potentiele inhibitor (4).

B E S P R E K I N G

6.1 Synthese van (S)-fenylalanine methyl ester hydrochloride[5]

Het methyl ester van (S)-fenylalanine (8) wordt bereid door op het aminozuur (7) een Fischer verestering uit te voeren in een met HCl(g) verzadigde CH₃OH oplossing. Saturatie van de oplossing dient wegens de exothermiciteit te gebeuren in een ijsbad. De reactie zelf verloopt 4 uur bij kamertemperatuur. De eindopbrengst bedraagt 72 % na kristallisatie.

6.2 Synthese van Boc-Lys(Z)-Phe-OMe^[6]

Men koppelt Phe-OMe.HCl (8) aan Boc-Lys(Z)-OH (9) in de aanwezigheid van3 eq. triethylamine door van het laatstvernoemde aminozuur (9) een actief ester te maken met 1.1 eq. TBTU. 1 eq. triethylamine wordt verbruikt om Boc-Lys(Z)-OH (9) om te zetten in zijn carboxylaat ion, wat vervolgens met TBTU reageert. Men merkt op dat er zich nog 0.1 eq. TBTU in het reactiemidden bevindt. Indien men TBTU in overmaat gebruikt, moet men ook Phe-OMe.HCl (8) in overmaat gebruiken. Men weet immers dat TBTU reageert met aminogroepen ter vorming van een Schiff base. 0.1 eq. Phe-OMe.HCl (8) kan deze nevenreactie ondergaan, terwijl 1 eq. moet overblijven om met het actieve ester te reageren. Daarom wordt 1.1 eq. Phe-OMe.HCl (8) toegevoegd, na een activatieperiode van 10 minuten. 1.1 eq. triethylamine wordt verbruikt om het amine (8) uit zijn zout vrij te zetten. Men bekomt na kristallisatie een opbrengst van 88 %.

Algemeen geldt voor TBTU koppelingen dat er even veel of minder racemisatie optreedt dan met carbodiimide. HPLC wijst niet uit dat racemisatie door oxazolonvorming zou hebben plaatsgevonden.

6.3 Synthese van cyclo[Lys(Z)-Phe]^[7]

Om van Boc-Lys(Z)-Phe-OMe (10) een diketopiperazine (11) te vormen, splitst men in een eerste stap de Boc groep af in mierezuur. Bij het evaporeren van het mierezuur dient men er vooral op te letten dat het waterbad niet warmer wordt dan 30 °C. Vervolgens refluxeert men het aldus ontstane dipeptide formaat zout in een 3 / 1 mengsel van 2-butanol / tolueen bij

98 °C. Tijdens het refluxeren wordt het mierezuur als een azeotroop verwijderd, waardoor het dipeptide achterblijft om te cycliseren.^[8] Door de lage diëlectrische constante van het solventsysteem wordt significante epimerisatie voorkomen.^[9] Gezien de hoge diëlectrische constante van mierezuur (58.5), mag men de temperatuur niet laten oplopen bij het uitdampen. Na cyclo[Lys(Z)-Phe] (11) te laten neerslaan, bedraagt de netto opbrengst 85 %. Er waren geen aanwijzingen in het HPLC chromatogram en op de dunne laag dat tijdens de ringvorming epimerisatie zou hebben plaatsgevonden.

6.4 Synthese van cyclo[Lys-Phe]^[10]

Men splitst de Z groep af in cyclo[Lys(Z)-Phe] (11) door een katalytische hydrogenolyse uit te voeren in glaciaal azijnzuur. Men gebruikt 0.5 gewichtsequivalent 10 % Pd / C als heterogene katalysator. De hydrogenolyse gebeurt bij 60 psi gedurende 2 uur. Uiteindelijk bekomt men een opbrengst van 94 %. Uit het HPLC chromatogram blijkt echter dat 4 % geëpimeriseerd is. Door 2 omkristallisaties hebben we getracht het percentage epimerisatie te reduceren. De meetfout in achting nemende, kon worden opgetekend dat geen significante verbetering van de zuiverheid werd waargenomen. Om ons ervan te verzekeren dat de epimerisatie niet is opgetreden wegens de zure condities bij de hydrogenolyse, lossen we de kristallen cyclo[Lys-Phe] (12) op in glaciaal azijnzuur. Na 8 uur is geen verdere epimerisatie opgetreden. Vermits in oplossingen met hoge diëlectische constante reeds bij 70 °C epimerisatie kan optreden,^[9] werd nagegaan of epimerisatie niet is opgetreden bij de zuivering van cyclo[Lys(Z)-Phe] (11) waar hete ethylacetaat werd gebruikt. Hiertoe werd opnieuw cyclo[Lys(Z)-Phe] (11) gesynthetiseerd en zonder voorafgaande zuivering werd het aan een hydrogenolyse onderworpen. In het chromatogram verscheen de epimeerpiek. Epimerisatie treedt dus niet op tijdens de zuivering. De chirale zuiverheid werd niet bewaard bij de koppeling of bij de cyclisatie.

6.5 Synthese van cylco[Lys(COCH2OBzl)-Phe]^[11]

De reactie van cyclo[Lys-Phe] (12) met benzyloxyacetylchloride wordt onder de getabelleerde condities uitgevoerd:

Er wordt in experiment 1 een overmaat van 2 eq. pyridine gebruikt omdat deze base assisteert bij de nucleofiele acyl substitutie door reactie met het zuurchloride. Hierbij wordt een acyl pyridinium intermediair gevormd.^[13] Men ziet op HPLC dat zelfs na 28 uur geen verdere conversie is opgetreden. We halen de slechte oplosbaarheid van het diketopiperazine (12) aan als oorzaak van de lage opbrengst.

Omdat cyclo[Lys-Phe] (12) oplost in een heftig geroerd CH₂Cl₂ / NaOH (aq) systeem, schakelen we over op de Schotten Baumann procedure.^[11] Hierbij wordt gewoonlijk een kleine overmaat (8 tot 15 %) NaOH gebruikt.^[14]. Wegens oplosbaarheidsproblemen ziet men ervan af het zuurchloride bij 0 °C toe te voegen.

Men ziet duidelijk dat het aanwenden van Schotten Baumann condities bij deze synthese een vereiste is.

6.6 Synthese van cylco[Lys(COCH2OH)-Phe]^[12]

Door een katalytische hydrogenatie uit te voeren op cyclo[Lys(COCH₂OBzl)-Phe] (13), splitst men de benzyl groep af. Als solventsysteem gebruikt men een 6 / 1 mengsel van methanol / water en 0.5 gewichtsequivalent 10 % Pd/C fungeert als katalysator. De hydrogenolyse verloopt bij 48 psi. Na 5 u 30 ziet men op het chromatogram dat de benzyl ontscherming slechts voor 92 % is doorgegaan. Daarom laat men de reactie nog 3 uur verder verlopen. HPLC wijst nu uit dat de conversie volledig is opgetreden. Rekristallisatie uit warme ethylacetaat levert een opbrengst van 95 %.

We merken op dat bij een vergelijkbare reactie in de literatuur mildere condities volstaan (0.17 g ewichtsequivalent 10 % Pd/C, hydrogenolyse bij 15 psi gedurende 6 uur).^[12]

6.7 Synthese van cylco[Lys(CONHOBzl)-Phe]

Verschillende synthese strategieën werden onderzocht om de meest gunstige condities te vinden voor de bereiding van cyclo[Lys(CONHOBzl)-Phe] (15).

6.7.1 Reacties met trifosgeen

Onderstaande tabel laat zien hoe men met trifosgeen een amine in zijn isocyanaat omzet. Dit isocyanaat laat men vervolgens reageren met een tweede amine om een ureum te bekomen.

Algemene Opmerking: Bij testreacties gebruikt men n-propylamine in plaats van cyclo[Lys-Phe]¨(12). Zo beperkt men het verbruik van het te derivatiseren diketopiperazine.

Bij de vorming van het isocyanaat, die optreedt in op in een CH₂Cl₂ / H₂O bifasisch systeem dat 3 eq Na₂CO₃ bevat, wordt een gelachtige pap gevormd. Er treedt mechanisch verlies op terwijl men deze pap bij het hydroxylamine voegt.

In experiment 1 bekomt men een bruto opbrengst van 22 %. HPLC wijst uit dat de bruto opbrengst voor 43 % bestaat uit cyclo[Lys(CONHOBzl)-Phe] (15). Door kristallisatie werd bijgevolg alle eindproduct (15) afgezonderd. Naast de piek van het eindproduct, ziet men op het chromatogram van de bruto opbrengst een ruis van een 15 tal ongeïdentificeerde nevenproducten. Men vindt het ongereageerde cyclo[Lys-Phe] (12) tesamen met

O-benzylhydroxylamine terug in de HCl fase. Dit wijst op dat een onvolledige reactie.

In de literatuur bekomt men voor een vergelijkbare reactie een opbrengst van 48 %.^[15]

Bij experiment 2 ziet men dat de opbrengst substantieel stijgt als men de overmaat trifosgeen vergroot. We vertrouwen erop dat door kristallisatie alle eindproduct werd afgezonderd.

We schrijven de lage opbrengst toe aan de slechte oplosbaarheid van cyclo[Lys-Phe].

Omdat het diketopiperazine (12) oplosbaar is in een basisch CH₃CN / H₂O mengsel onderzoeken we in experiment 5 of de reactie niet uitvoerbaar is in zulk een homogeen midden. Men stelt echter in deze testreactie met n-propylamine vast dat uitsluitend

N,N’-dipropylureum wordt gevormd. Aldus is de poging om het oplosbaarheidsprobleem te omzeilen, mislukt.

Het zou interessant zijn om O-benzylhydroxylamine in zijn isocyanaat om te zetten omdat men zo een grote overmaat isocyanaat kan toevoegen aan het diketopiperazine (12). Men neemt waar dat O-benzylhydroxylamine met zijn eigen isocyanaat reageert ter vorming van

volgend symmetrisch ureum (16):

Cyclo[Lys-Phe] (12) wordt integraal teruggevonden in de waterfase. In een volgend experiment heeft men getracht de vorming van N,N’-di(O-benzylhydroxy)ureum (16) te vermijden door:

1) Het hydroxylamine langzaam toe te druppelen aan de trifosgeenoplossing zodat er steeds een overmaat trifosgeen aanwezig is.

2) De reactietijd voor de vorming van het isocyanaat terug te brengen tot 30 minuten.

De vorming van het asymmetrisch ureum treedt niet op, alleen (16) wordt teruggevonden..

6.7.2 Reactie met p-nitrofenyl chloroformaat

We onderzoeken in de volgende testreacties of het niet mogelijk is de opbrengst te verhogen met p-nitrofenyl chloroformaat.

Men laat n-propylamine reageren met p-nitrofenyl chloroformaat tot het overeenkomstige carbamaat, dat vervolgens wordt toegevoegd aan O-benzylhydroxylamine om zo het ureum te vormen.

Opmerking: Men schat de opbrengst op basis van een HPLC analyse op de bruto opbrengst.

Bij de vorming van het carbamaat is het van belang n-propylamine druppelsgewijs toe te voegen aan de p-nitrofenyl chloroformaat oplossing. Men wil immers vermijden dat

n-propylamine met het gevormde carbamaat reageert ter vorming van N,N’-dipropylureum. In experiment 1 kleurt het reactiemidden geel na 35 minuten (p-nitrofenol). Dit wijst op het optreden van de hoger geschetste nevenreactie. Men heeft niet kunnen quantificeren hoeveel nevenproduct gevormd werd gezien bij de afwerking veelvuldig gewassen moet worden met een K₂CO₃ (aq) oplossing om p-nitrofenol te extraheren. Hierbij migreert het symmetrisch ureum naar de waterfase.

Men heeft de opbrengst kunnen verhogen door:

 1) Een overmaat p-nitrofenyl chloroformaat te gebruiken

2) DMAP te gebruiken om de vorming van het carbamaat te versnellen.

Nu kleurt het reactiemidden na 50 minuten geel.

We besluiten dat deze strategie geenszins tot verbetering leidt vermits:

1) De opbrengst lager is

2) Symmetrisch ureum als nevenproduct gevormd wordt

3) De afwerking langer is.

6.7.3 Reactie met fenyloxycarbonylsuccinimide^[18]

Om de opbrengst te verbeteren stellen we voor het meer stabiele fenyl carbamaat te synthetiseren. Hierdoor zal de vorming van het symmetrisch ureum voorkomen worden. Het fenyl carbamaat zal men afzonderen en onderwerpen aan een reactie met

O-(t-butyldimethylsilyl)hydroxylamine.

Vorming van het fenyl carbamaat

In een 4 /2 oplossing van dioxaan / water laat men n-propylamine gedurende 1 uur reageren met 1 eq. fenyloxycarbonylsuccinimide. De bruto opbrengst is zuiver en bedraagt 96 %.

Vorming van het ureum

We proberen een reactie teweeg te brengen tussen het hierboven gevormde carbamaat en 1eq.

O-(t-butyldimethylsilyl)hydroxylamine onder de volgende condities:

Het reactieverloop werd gevolgd met HPLC.

De conclusie luidt dat het carbamaat te weinig reactief is.

6.8 Synthese van cyclo[Lys(CONHOH)-Phe]

We stellen voor de benzyl ontscherming op cyclo[Lys(CONHOBzl)-Phe] (15) te laten verlopen onder dezelfde omstandigheden als in § 6.6 omdat de hydrogenolyse op cyclo[Lys(COCH₂OBzl)-Phe] (13) slechts verliep onder condities die – in vergelijking met deze uit de literatuur- meer drastisch zijn.

Na kristallisatie bekomt men slechts een opbrengst van 68 %.

Een aantal bevindingen suggereren dat tijdens de hydrogenolyse het hydroxyureum partieel gereduceerd werd tot cyclo[Lys(CONH₂)-Phe].

Op het chromatogram vindt men dat de hoofdpiek (R_t = 10.69) niet is opgesplitst. Verder treft men een onzuiverheid aan (R_t = 14.5; 7.4 %).

LC /MS bevestigt dat de hoofdpiek niet is opgesplitst en geeft voor deze piek de volgende fragmentatie:

LC / MS (ES+):

met M = cyclo[Lys(CONHOH)-Phe]

 M’ = cyclo[Lys(CONH₂)-Phe]

Er elueert verder geen piek met m/z = 319.

Massaspectrometrie laat zien dat er niet alleen een M + Na piek, maar ook een M’ + Na piek wordt aangetroffen:

MS (ES+):

Dit doet vermoeden dat de piek met m/z = 319 staat voor M’ + H.

Het nevenproduct zou in dit geval dezelfde retentietijd hebben als het hydroxyureum.

We onderzoeken de situatie verder met ¹H NMR.